中性土壤速效磷含量检测

发布时间:2025-06-28 08:01:39 阅读量:1 作者:生物检测中心

中性土壤速效磷含量检测方法详解 (碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法)

实验目的:
准确测定中性土壤中能被植物短期吸收利用的磷素形态(速效磷含量),为科学施肥、土壤肥力评价及环境保护提供关键依据。

方法原理:
针对中性土壤环境(pH 6.5 - 7.5),本方法采用 0.5 mol/L 碳酸氢钠 (NaHCO₃) 溶液(pH 8.5) 作为浸提剂。其作用机理为:

  1. 碱性环境与同离子效应: 碳酸氢钠溶液呈弱碱性(pH 8.5),能有效降低土壤胶体对钙、铝、铁等阳离子的溶解度,减弱它们对磷的固定作用。同时,溶液中高浓度的HCO₃⁻离子能与土壤溶液中的Ca²⁺形成CaCO₃沉淀,降低Ca²⁺活度,从而解吸被钙固定的磷(如磷酸二钙、磷酸八钙)。
  2. 阴离子交换: HCO₃⁻离子能与土壤固相表面吸附的磷酸根离子(如铁铝氧化物表面吸附的磷)进行交换,使其释放到溶液中。
  3. 比色测定: 浸提出来的磷酸根离子,在酸性条件下,与钼酸铵反应生成磷钼杂多酸。此杂多酸在还原剂抗坏血酸(由钼锑抗试剂提供)作用下,被还原生成稳定的蓝色络合物——磷钼蓝。其蓝色的深浅在一定浓度范围内与磷含量成正比,可在特定波长(通常为 880 nm 或 700 nm)下用分光光度计进行定量测定。加入酒石酸锑钾能催化反应,使显色更迅速、稳定。
 

适用范围:
本方法(通常称为 Olsen 法或其改良法)特别适用于中性至石灰性土壤(pH > 6.5) 中速效磷含量的测定。对于酸性土壤(pH < 6.5),通常推荐使用 Bray I 法(0.03 mol/L NH₄F + 0.025 mol/L HCl)或 Mehlich 3 法等。

主要试剂与材料:
注意:所有试剂均需使用分析纯及以上级别,配制溶液用水为去离子水或重蒸水。

  1. 浸提剂 (0.5 mol/L NaHCO₃, pH 8.5): 称取 42.0 g 无水碳酸氢钠 (NaHCO₃) 溶于约 800 mL 水中,用 1 mol/L NaOH 溶液调节 pH 值至 8.5 (使用精密 pH 计校准),转移至 1 L 容量瓶中,定容摇匀。此溶液应储存于聚乙烯瓶中,避免接触空气以防 pH 变化,存放时间不宜过长(建议现配现用或每周重配)。
  2. 无磷活性炭: 用于消除有机质干扰。若土壤有机质含量较高(>5%),需使用经酸洗、去除了磷杂质的活性炭。使用前需检查其不含磷。
  3. 钼锑抗显色剂:
    • A 液 (5 g/L 酒石酸锑钾溶液): 准确称取 0.5 g 酒石酸锑钾 (KSbOC₄H₄O₆·1/2H₂O),溶于 100 mL 水中。
    • B 液 (钼酸铵-硫酸溶液): 量取 153 mL 浓硫酸(优级纯),缓缓加入到约 400 mL 水中,边加边搅拌,冷却至室温。称取 10.0 g 钼酸铵 [(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O] 溶于约 60℃ 的 300 mL 水中,冷却。将硫酸溶液缓缓倒入钼酸铵溶液中,边倒边搅拌,再加 0.5 g 酒石酸锑钾(A液),用水定容至 1 L。储于棕色瓶中。
    • 钼锑抗贮存液: 临用前当天配制。取 100 mL B 液,加入 1.5 g 抗坏血酸 (C₆H₈O₆),溶解摇匀。此混合液不稳定,应避免阳光直射,并在 24 小时内使用。也可将抗坏血酸单独配成溶液,使用时按比例混合。
  4. 磷标准溶液:
    • 磷标准储备液 (100 mg/L P 或 50 μg/mL P): 准确称取经 105℃ 烘干的磷酸二氢钾 (KH₂PO₄) 0.4394 g,溶于水中,加入 5 mL 浓硫酸(防腐),转移至 1 L 容量瓶中,定容摇匀。
    • 磷标准工作液 (5 mg/L P 或 5 μg/mL P): 准确吸取磷标准储备液 10.00 mL 于 200 mL 容量瓶中,用水定容摇匀。
 

主要仪器设备:

  1. 分光光度计 (波长范围覆盖 700 - 900 nm)
  2. 恒温往复式或旋转式振荡机 (振荡速率可调至约 180 ± 20 次/分钟)
  3. 离心机 (转速 ≥ 3000 rpm,配 50 mL 离心管) 或定量滤纸 (中速,无磷)
  4. 精密天平 (感量 0.01 g)
  5. 移液管或可调移液器 (1 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL 等)
  6. 容量瓶 (50 mL, 100 mL, 1000 mL)
  7. 三角瓶 (150 - 200 mL) 或专用浸提瓶
  8. 具塞刻度试管 (25 mL 或 50 mL) 或比色管
  9. 恒温水浴锅 (控温 ± 1℃) 或控温室
  10. pH 计 (精度 ± 0.01)
  11. 定时器
 

操作步骤:

  1. 样品制备: 采集的代表性土壤样品经风干、剔除杂物、研磨,过 2 mm (10 目) 筛。混匀备用。
  2. 称样: 准确称取过 2 mm 筛的风干土样 5.00 g (精确至 0.01 g),置于干燥洁净的 150 - 200 mL 三角瓶或专用浸提瓶中。
  3. 加浸提剂: 用量筒或移液管准确加入 50.0 mL 0.5 mol/L NaHCO₃ 浸提剂 (预先恒温至 25 ± 1℃)。
  4. 加活性炭 (可选): 若土壤有机质含量 > 5%,需在加入浸提剂后立即加入约 1 g 无磷活性炭(需预先通过试验确定最佳用量,以消除干扰且不影响磷提取为准)。
  5. 振荡浸提: 立即盖上瓶塞,置于已预热至 25 ± 1℃ 的恒温振荡机上。以 180 ± 20 次/分钟 的频率振荡 30 ± 1 分钟。严格控制温度和时间是获得重现性结果的关键。
  6. 过滤/离心:
    • 离心法 (推荐): 将浸提液迅速倒入干燥洁净的 50 mL 离心管中,立即在 3000 - 4000 rpm 下离心 10 - 15 分钟,使溶液澄清。小心吸取上清液用于测定。
    • 过滤法: 将浸提液迅速倾倒在干燥洁净、折放好的中速无磷定量滤纸上,滤入干燥洁净的锥形瓶或烧杯中。弃去最初少量浑浊滤液(约 5 mL),收集后续清晰滤液用于测定。过滤过程应迅速,避免磷被碳酸钙再吸附。
  7. 显色测定:
    • 准确吸取 5.00 - 20.00 mL 浸提液 (含磷量在 0.4 - 20 μg 之间为宜,若磷含量高需减少吸取量或稀释滤液) 于 50 mL 容量瓶或具塞刻度试管中。用少量水冲洗瓶颈。
    • 空白试验: 另取一支容量瓶/试管,加入与样品吸取浸提液体积相同的 0.5 mol/L NaHCO₃ 浸提剂
    • 标准曲线: 准确吸取磷标准工作液 (5 μg/mL P) 0.0, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0 mL 于一系列 50 mL 容量瓶/试管中,各加入 5.0 mL 0.5 mol/L NaHCO₃ 浸提剂(使标准系列与样品测定条件一致),加水至约 20 - 30 mL。
    • 所有 样品管、空白管和标准管中,准确加入 5.00 mL 钼锑抗显色剂。立即充分摇匀,排出 CO₂ 气泡。
    • 用水定容至 50 mL 刻度,再次充分摇匀。
    • 室温下放置 30 分钟 (或置于 25℃ 恒温水浴中保温 15 - 30 分钟),使显色完全且稳定。
    • 在分光光度计上,选用 1 cm(或 2 cm)光径比色皿,以 空白试剂(0浓度标准管) 为参比,于 880 nm 波长(若无此波长,可用 700 nm,但灵敏度略低)处测定各溶液的吸光度 (A)。
  8. 绘制标准曲线: 以标准系列磷含量(μg)为横坐标,相应吸光度(A)为纵坐标,绘制标准曲线。或用最小二乘法建立线性回归方程 (A = a + b * μg P)。
 

结果计算:

  1. 从标准曲线或回归方程求出测定液中磷含量 (μg):
    < data-sourcepos="null:null-null:null" xmlns="http://www.w3.org/1998/Math/MathML">W待测=(A样品a)bW_{\text{待测}} = \frac{(A_{\text{样品}} - a)}{b}

    • < data-sourcepos="null:null-null:null" xmlns="http://www.w3.org/1998/Math/MathML">W待测W_{\text{待测}}:样品测定液中磷的质量(微克,μg)
    • < data-sourcepos="null:null-null:null" xmlns="http://www.w3.org/1998/Math/MathML">A样品A_{\text{样品}}:待测样品浸提液的吸光度
    • < data-sourcepos="null:null-null:null" xmlns="http://www.w3.org/1998/Math/MathML">aa:标准曲线截距
    • < data-sourcepos="null:null-null:null" xmlns="http://www.w3.org/1998/Math/MathML">bb:标准曲线斜率(μg⁻¹)
  2. 计算土壤速效磷含量:
    < data-sourcepos="null:null-null:null" xmlns="http://www.w3.org/1998/Math/MathML">土壤速效磷 (P, mg/kg)=W待测×Vm×V×103×f\text{土壤速效磷 (P, mg/kg)} = \frac{W_{\text{待测}} \times V_{\text{总}}}{m \times V_{\text{测}} \times 10^3} \times f

    • < data-sourcepos="null:null-null:null" xmlns="http://www.w3.org/1998/Math/MathML">W待测W_{\text{待测}}:从标准曲线查得或计算出的待测液中磷的质量(μg)
    • < data-sourcepos="null:null-null:null" xmlns="http://www.w3.org/1998/Math/MathML">VV_{\text{总}}:浸提剂总体积(mL),此处为 50.0 mL
    • < data-sourcepos="null:null-null:null" xmlns="http://www.w3.org/1998/Math/MathML">VV_{\text{测}}:测定时吸取浸提液的体积(mL)
    • < data-sourcepos="null:null-null:null" xmlns="http://www.w3.org/1998/Math/MathML">mm:风干土壤样品质量(g)
    • < data-sourcepos="null:null-null:null" xmlns="http://www.w3.org/1998/Math/MathML">10310^{-3}:将 μg 转换为 mg 的系数
    • < data-sourcepos="null:null-null:null" xmlns="http://www.w3.org/1998/Math/MathML">ff:将风干基结果换算为烘干基结果的系数(< data-sourcepos="null:null-null:null" xmlns="http://www.w3.org/1998/Math/MathML">f=100100土壤含水率f = \frac{100}{100 - \text{土壤含水率}})。若要求风干基结果,则 f = 1。如需报告烘干基结果,需另测土壤含水率。
 

示例:
称土样 5.00 g,加 50.0 mL 浸提剂振荡。吸取 10.00 mL 滤液显色测定,测得吸光度从标准曲线查得相当于 8.0 μg P。土壤含水率为 5%。

  • 风干基结果:速效磷 (P, mg/kg) = (8.0 μg × 50.0 mL) / (5.00 g × 10.00 mL × 1000) × 1000 = 8.0 mg/kg
  • 烘干基结果:含水率 5%,则 f = 100 / (100-5) ≈ 1.0526。速效磷 (P, mg/kg) = 8.0 × 1.0526 ≈ 8.4 mg/kg
 

注意事项与质量控制:

  1. 温度控制: 浸提温度必须严格控制在 25 ± 1℃。温度升高会增加浸提量,降低重现性。
  2. 振荡时间与频率: 确保振荡时间精确为 30 分钟,频率稳定在 180 ± 20 次/分钟。不同振荡机可能需校准其实际振荡强度。
  3. 浸提液处理: 振荡结束后应立即进行过滤或离心,避免长时间放置导致磷再吸附。过滤必须使用无磷滤纸,滤液需清澈透明。
  4. 显色条件: 显色酸度和钼酸铵浓度必须准确。加入钼锑抗试剂后需立即充分摇匀。显色时间与温度影响颜色稳定性,应保持一致。显色完成后宜在 1 小时内完成比色。
  5. 试剂纯度与有效期: 确保试剂纯度符合要求。NaHCO₃ 溶液易吸收 CO₂ 导致 pH 下降,应每周检查 pH 或现配现用。钼锑抗显色剂需现用现配(尤其含抗坏血酸的混合液)。
  6. 标准曲线: 每次测定或每批样品都应同步制作标准曲线。标准曲线相关系数 R² 应 ≥ 0.999。
  7. 样品代表性: 土壤样品必须具有代表性,风干、研磨、过筛过程需规范,避免污染。
  8. 活性炭使用: 有机质高的土壤必须使用无磷活性炭,并预先验证其用量和有效性。活性炭本身可能吸附少量磷,需在标准系列中加入等量活性炭浸提剂进行校正。
  9. 空白试验: 必须做试剂空白(用浸提剂代替样品液),其吸光度应很低且稳定。
  10. 精密度: 进行平行双样测定。两份平行样测定结果的相对偏差应 ≤ 10%(含量 >10 mg/kg)或 ≤ 15%(含量 ≤10 mg/kg)。
  11. 准确度: 可使用有证标准土壤样品进行测定,结果应在证书给出的不确定度范围内。
  12. 干扰因素: 高浓度硅 (>60 mg/L Si) 可能干扰显色,但土壤浸提液中硅浓度通常低于此限。亚硝酸盐会破坏钼蓝,但碳酸氢钠浸提液中极少存在。强还原物质可能消耗氧化剂,但活性炭处理可消除大部分干扰。铁含量过高也会干扰,活性炭有助于去除。
  13. 安全: 浓硫酸、钼酸铵、酒石酸锑钾等试剂具有腐蚀性或毒性,操作时需佩戴防护眼镜、手套,在通风良好处进行。含砷试剂(如旧法中的抗坏血酸常含微量砷)尤其需要注意防护和废液处理规范。废液应妥善收集处理。
 

结果应用:

测定得到的土壤速效磷含量(mg/kg)是评价土壤供磷能力的重要指标:

  • 磷肥推荐: 根据作物需磷特性和土壤速效磷丰缺指标(通常分为极低、低、中、高、极高等级),制定合理的磷肥施用量和施用方法,既能满足作物需求,又能避免浪费和环境污染。
  • 土壤肥力评价: 速效磷是土壤肥力分级的重要参数之一。
  • 环境风险评估: 长期过量施用磷肥可能导致表层土壤磷素大量累积,容易通过地表径流或淋溶进入水体,造成富营养化。监测土壤磷含量有助于评估环境风险。
  • 科学研究: 研究土壤磷循环、磷素有效性、磷肥利用率等的关键基础数据。
 

通过严格遵守操作规程和质量控制要求,本方法能够准确、可靠地测定中性土壤中的速效磷含量,为农业生产和环境保护决策提供科学依据。