3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)活性检测

3-磷酸甘油醛脱氢酶 (GAPDH) 活性检测方案

一、 检测原理

3-磷酸甘油醛脱氢酶 (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH, EC 1.2.1.12) 是糖酵解途径中的关键酶。本检测基于其催化甘油醛-3-磷酸 (G3P) 氧化磷酸化的反应。在该反应中，G3P 被无机磷酸 (Pi) 和无机砷酸盐 (As) 氧化，形成 1,3-二磷酸甘油酸 (1,3-BPG)，同时将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD⁺) 还原为 NADH。NADH 在 340 nm 波长处具有特征吸收峰。因此，通过监测 340 nm 处吸光度值 (A₃₄₀) 随时间增加的速率 (ΔA₃₄₀/min)，即可计算出 GAPDH 的活性。

反应方程式：

二、 试剂配制 (所有试剂均需使用分析纯及以上级别，水为去离子水或超纯水)

1. Tris-HCl-砷酸盐缓冲液 (100 mM, pH 8.6):

   • 溶解 12.1 g 三羟甲基氨基甲烷 (Tris) 于约 800 mL 水中。
   • 用浓盐酸调节 pH 至 8.6。
   • 加入 34.6 g 砷酸钠 (Na₂HAsO₄·7H₂O) 或等效量的无水砷酸钠 (计算调整)。
   • 搅拌至完全溶解。
   • 加水定容至 1000 mL。
   • 4°C 避光保存。警告：砷酸盐剧毒，操作时佩戴防护用具，废弃物按有害化学废物处理。

2. NAD⁺ 溶液 (25 mM):

   • 称取适量 NAD⁺ (游离酸形式)，用去离子水溶解配制成 25 mM (约 16.6 mg/mL) 溶液。
   • 临用前配制，或分装后 -20°C 冷冻保存，避免反复冻融。

3. 甘油醛-3-磷酸 (G3P) 溶液 (15 mM):

   • 通常使用甘油醛-3-磷酸二乙基缩醛钡盐或锂盐。
   • 若为钡盐：
     • 称取适量 G3P 钡盐。
     • 加入适量硫酸钠溶液 (约 0.2 M) 沉淀钡离子 (生成 BaSO₄)。
     • 离心 (如 10,000 g, 10 min) 去除沉淀。
     • 收集上清液，用 Tris-HCl 缓冲液 (不含砷酸盐，pH 7.0-7.5) 稀释至所需浓度 (15 mM)。测定上清液中的实际 G3P 浓度 (通常用 GAPDH 酶偶联法)。
   • 若为锂盐： 称取适量 G3P 锂盐，直接用去离子水溶解稀释至 15 mM。
   • 校准浓度后，分装，-20°C 冷冻保存。避免反复冻融。溶液不稳定，临用前配制最佳。

4. 待测酶液 (Sample):

   • 根据样品类型 (组织匀浆液、细胞裂解液、纯化酶液等)，用合适的缓冲液 (如 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 含 1 mM EDTA, 5 mM β-巯基乙醇或 1 mM DTT) 制备。缓冲液通常需含蛋白酶抑制剂。
   • 样品应澄清或经高速离心去除不溶物。
   • 酶液浓度应调整至使其在检测体系中的反应速率在分光光度计的线性检测范围内 (通常 ΔA₃₄₀/min 在 0.01 到 0.15 之间)。

三、 仪器设备

1. 紫外-可见分光光度计 (带恒温比色槽)
2. 石英比色皿 (光程 1 cm)
3. 恒温水浴锅或恒温循环器
4. 移液器 (精确至 μL 级) 及配套吸头
5. 计时器
6. 微量离心机 (用于样品前处理)
7. pH 计

四、 操作步骤 (以 1 mL 反应体系为例)

1. 预热： 开启分光光度计，设定波长为 340 nm。将恒温比色槽温度设定并稳定在 25°C (或其他所需温度，如 30°C 或 37°C，但要明确记录)。预热所用试剂 (缓冲液、NAD⁺、G3P) 至反应温度。
2. 空白对照管 (Blank)：
   • 在石英比色皿中加入：
     • 940 μL Tris-HCl-砷酸盐缓冲液 (100 mM, pH 8.6)
     • 50 μL NAD⁺ 溶液 (25 mM) -> 终浓度 1.25 mM
     • 10 μL 去离子水 (或稀释样品的缓冲液)
   • 轻轻混匀。
   • 放入已预热的比色槽中，恒温平衡 3-5 分钟。
   • 读取初始 A₃₄₀ 值或调零。
3. 样品测定管 (Test)：
   • 在另一石英比色皿中加入：
     • 930 μL Tris-HCl-砷酸盐缓冲液 (100 mM, pH 8.6)
     • 50 μL NAD⁺ 溶液 (25 mM) -> 终浓度 1.25 mM
     • 10 μL 待测酶液 (体积需根据酶活力调整)
   • 轻轻混匀。
   • 放入已预热的比色槽中，恒温平衡 3-5 分钟。
   • 加入 10 μL G3P 溶液 (15 mM) -> 终浓度 0.15 mM。立即上下吹打混匀数次（避免产生气泡），同时启动计时器。
4. 吸光度监测：
   • 立即将比色皿放入光路中。
   • 连续监测 340 nm 处吸光度值的变化至少 3-5 分钟，或直至获得稳定的线性变化区间。记录数据点间隔时间 (如每 15 或 30 秒)。

五、 数据处理与计算

1. 计算反应速率 (ΔA₃₄₀/min):

   • 选择反应开始后吸光度线性变化的阶段（通常在加入底物 G3P 后 30 秒至 3 分钟内）。
   • 以时间 (min) 为横坐标，吸光度值 (A₃₄₀) 为纵坐标作图。
   • 计算线性区段的斜率 (ΔA₃₄₀ / Δt)，此斜率即为每分钟吸光度的变化值 (ΔA₃₄₀/min)。单位：ΔA/min。
   • 注意： 如有必要，需减去空白对照管在相应时间内的吸光度变化（通常空白变化很小可忽略，但需验证）。

2. 计算酶活性 (U/mL 或 U/mg):
   NADH 在 340 nm 处的摩尔消光系数 (ε) 为 6.22 L·mmol⁻¹·cm⁻¹ (在 pH 7-8 范围内基本恒定)。使用以下公式计算酶活性：

六、 关键注意事项

1. 精确性： 精确配制试剂、校准 pH、准确移液是获得可靠结果的基础。
2. 温度控制： 酶促反应速率对温度敏感，必须严格控制反应温度并在计算时注明。
3. 试剂稳定性：
   • NAD⁺ 溶液： 易吸湿降解，建议临用前配制，或分装冷冻保存，避免反复冻融。
   • G3P 溶液： 非常不稳定（尤其是在中性pH以上），易水解和氧化。务必使用高纯度试剂，严格校准浓度（推荐使用纯 GAPDH 酶标定），强烈建议临用前新鲜配制。解冻后置于冰上。
   • 含砷酸盐缓冲液： 4°C 避光保存相对稳定，但长时间放置仍可能变化，建议定期检查 pH。
4. 硫醇保护： GAPDH 活性高度依赖于其活性位点半胱氨酸残基的还原状态。样品制备缓冲液中 必须 包含还原剂 (如 1-5 mM β-巯基乙醇或 1 mM DTT)。检测缓冲液中虽无额外添加，但样品带入的还原剂通常足够保护。
5. 线性范围： 确保检测过程中 ΔA₃₄₀/min 是恒定的（线性期）。初始 A₃₄₀ 应较低 (<0.1)。若速率过快 (ΔA₃₄₀/min > 0.15) 或过慢 (<0.01)，需相应稀释或浓缩酶液。反应时间不宜过长，避免底物消耗或产物抑制。
6. 砷酸盐毒性： 严格遵循实验室安全规范操作含砷试剂，全程佩戴手套、防护眼镜，在通风橱内配制，废弃物专门收集处理。避免接触皮肤和吸入粉尘。
7. 空白对照： 务必设置不含底物 G3P 的空白对照 (可用水或缓冲液代替)，以扣除酶液中可能存在的内源性 NADH 氧化/还原物质的影响。在本方案中，样品管加入酶液后再加底物启动反应，空白管不加底物，能有效扣除样品自身背景。
8. 混匀： 加入启动反应的底物 (G3P) 后，必须立即彻底混匀反应液，确保反应同步启动。
9. 特异性： 此法检测的是依赖于砷酸盐和 NAD⁺ 的 GAPDH 活性。需确保样品中无显著干扰此反应的酶（如高活力的乳酸脱氢酶LDH消耗NADH，或谷胱甘肽还原酶GR再生NAD⁺）。通常样品适当稀释可降低干扰。

七、 方案优化与调整

• 反应体系体积： 可根据分光光度计要求调整为 0.5 mL 或 0.25 mL，需按比例调整各试剂用量并重新计算公式中的体积因子 (V_t / V_s)。
• 底物浓度： 本方案使用的 G3P (0.15 mM) 和 NAD⁺ (1.25 mM) 浓度通常在测定接近 Vmax 活性的范围内。如需进行动力学研究 (Km, Vmax)，需固定一种底物浓度，系统改变另一种底物浓度。注意 G3P 浓度过高可能抑制酶活性。
• pH 值： pH 8.6 是常用的接近最适 pH 的条件。如需研究 pH 依赖性，可在缓冲能力足够强的缓冲体系中（如 Tris）改变 pH。
• 激活剂/抑制剂研究： 可在反应体系中加入待研究的化合物，观察其对酶活性的影响。

总结：

本方案提供了基于分光光度法在 340 nm 监测 NADH 生成速率来测定 3-磷酸甘油醛脱氢酶 (GAPDH) 活性的详细步骤。关键在于使用新鲜、准确的底物（特别是 G3P），严格控制反应条件（温度、pH），保护酶的巯基活性中心，正确设置空白对照，并合理稀释样品以确保反应在线性范围内进行。严格遵守安全规定处理剧毒砷酸盐。计算结果时使用 NADH 标准摩尔消光系数 6.22 L·mmol⁻¹·cm⁻¹ 和相应的体积因子进行换算。该方法是研究 GAPDH 功能、代谢调控及作为内参标准化的重要工具。