乙酰辅酶A羧化酶(ACC)活性检测

发布时间：2025-06-28 08:01:39 阅读量：1 作者：生物检测中心

乙酰辅酶A羧化酶活性检测详解

一、引言

乙酰辅酶A羧化酶是脂肪酸生物合成途径中的第一个限速酶，催化乙酰辅酶A转化为丙二酰辅酶A。该酶活性调控异常与肥胖、II型糖尿病、非酒精性脂肪肝及多种癌症的发生发展密切相关。因此，准确检测ACC活性对于深入理解代谢调控机制及疾病病理生理学至关重要。

二、检测原理

目前主要的ACC活性检测方法基于其催化的两步反应：

  1. 核心反应：

    • 乙酰辅酶A + HCO₃⁻ + ATP → 丙二酰辅酶A + ADP + Pi

  2. 检测策略： 追踪反应产物或底物消耗。

    • 放射性同位素法（最经典、灵敏）： 使用放射性标记的底物（¹⁴C-碳酸氢盐 H¹⁴CO₃⁻）。
      • 反应终止后，通过酸化和加热（或真空干燥）将未反应的挥发性H¹⁴CO₃⁻去除。
      • 反应固定的非挥发性¹⁴C-丙二酰辅酶A（或经酶水解的¹⁴C-丙二酸）保留在溶液中，用液体闪烁计数仪测定其放射性强度（CPM），代表生成的丙二酰辅酶A量（即ACC活性）。
    • 比色/分光光度法：
      • NADPH偶联法（间接）： ACC催化产生的ADP，在丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶存在下，通过消耗NADPH生成丙酮酸和乳酸。监测340nm处NADPH吸光度的下降速率，间接反映ACC活性。
      • 丙二酰辅酶A衍生化法（直接）： 反应生成的丙二酰辅酶A在强酸存在下被水解为丙二酸，丙二酸与硫代巴比妥酸反应生成在532nm或550nm处有特征吸收峰的加合物（MDA-TBA加合物），通过比色测定其吸光度值定量ACC活性。
 

三、实验步骤（以放射性同位素法为例）

  1. 组织/细胞样品制备：

    • 组织匀浆： 将新鲜或冻存组织在预冷的匀浆缓冲液中（如：50mM HEPES-KOH pH 7.5, 100mM KCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 1mM DTT, 蛋白酶抑制剂混合物）高速匀浆。
    • 细胞裂解： 收集细胞，用预冷的裂解缓冲液（成分近似匀浆缓冲液）裂解。
    • 离心： 将匀浆液/裂解液在4°C下离心（如：10, 000-20, 000 ×g, 15-30分钟）。
    • 上清液： 收集上清液作为粗酶提取物（含ACC）。测定蛋白质浓度（如BCA法）以便后续标准化。

  2. 反应体系配置（示例，可根据文献优化）：

    • 在预冷的反应管或酶标板孔中加入：
      • 组织/细胞粗酶提取物（适量蛋白，如20-100μg）
      • 反应缓冲液（终浓度：如100mM Tris-HCl pH 7.5, 50mM KCl, 10mM MgCl₂, 10mM NaHCO₃）
      • 乙酰辅酶A（终浓度：如1-2mM）
      • ATP（终浓度：如5-10mM）
      • H¹⁴CO₃⁻（适量放射性活度，如0.2-0.5 μCi/管）
    • 总体积：通常50-100μL。
    • 零时对照： 在加入酶液前或加入后立即终止反应（见下一步），用于扣除本底。
    • 空白对照： 不含酶液（用缓冲液代替）的反应体系。

  3. 启动反应与孵育：

    • 将反应混合液（除终止液外）置于37°C水浴或恒温振荡器中，启动反应。
    • 根据酶活性和线性范围确定孵育时间（通常10-60分钟）。

  4. 终止反应：

    • 加入强酸终止液（如6M HCl，50-100μL）。
    • 涡旋混匀，确保完全酸化。

  5. 去除未反应的¹⁴CO₃⁻：

    • 将反应管置于加热块/烘箱中（如70-95°C）干燥或使用真空离心浓缩仪干燥。干燥过程使未反应的H¹⁴CO₃⁻以¹⁴CO₂形式挥发逸出。
    • 关键： 确保彻底干燥以去除所有未固定放射性。

  6. 溶解固定产物与放射性计数：

    • 向干燥后的管中加入适量的蒸馏水（如200μL）溶解固定的¹⁴C-丙二酰辅酶A/¹⁴C-丙二酸。
    • 加入足量的液体闪烁液（如2-5mL）。
    • 涡旋混匀。
    • 在液体闪烁计数仪上测定各管的放射性计数（CPM）。

  7. 数据处理：

    • 计算净放射性计数：净CPM = 样品管CPM - 零时对照管CPM
    • 扣除空白对照（如有必要）。
    • 活性计算：
      • 根据加入的H¹⁴CO₃⁻的比活度（dpm/nmol）将净CPM转换为固定HCO₃⁻的摩尔数（nmol）。
      • 酶活性（nmol/min/mg蛋白）= （固定HCO₃⁻的nmol数）/（反应时间 min）/（加入蛋白量 mg）
 

四、比色法补充要点（丙二酰辅酶A衍生化法）

  1. 反应终止与衍生化：
    • 反应结束后，加入含有三氯乙酸或高氯酸的终止/衍生化试剂（如10% TCA），使丙二酰辅酶A水解为丙二酸。
    • 离心去除沉淀蛋白质。
    • 取上清液，加入硫代巴比妥酸溶液。
    • 加热（如95-100°C, 30-60分钟）使丙二酸与TBA反应生成粉红色MDA-TBA加合物。
  2. 比色测定：
    • 冷却后，在532nm或550nm波长下测定吸光度。
  3. 标准曲线：
    • 使用已知浓度的丙二酸标准品代替酶反应体系，经相同衍生化步骤制作标准曲线。
  4. 活性计算：
    • 根据标准曲线将样品吸光度值转换为生成的丙二酸量（nmol）。
    • 酶活性（nmol/min/mg蛋白）= （生成丙二酸nmol数）/（反应时间 min）/（加入蛋白量 mg）
 

五、关键质量控制与注意事项

  1. 样品新鲜度与处理： 快速操作，冰浴保持低温，避免反复冻融样品。
  2. 酶活性线性范围： 必须预先确定反应时间与蛋白量在酶活性呈线性的范围内进行实验。
  3. 对照设立： 零时对照、空白对照必不可少。阳性对照（如已知活性的酶制剂）有助于确认体系有效性。
  4. 底物浓度： ATP、乙酰辅酶A、HCO₃⁻浓度需充足且优化，避免成为限速因素。
  5. 抑制剂/激活剂： 研究调节剂时，需设立溶剂对照。
  6. 同位素安全： 严格遵守放射性同位素实验室操作规程，做好个人防护和废物处理。
  7. 缓冲液pH与离子强度： ACC活性对pH和离子环境敏感，务必准确配置反应缓冲液。
  8. 温度控制： 孵育温度需精确维持在37°C。
 

六、方法选择与应用

  • 放射性同位素法： 灵敏度高、特异性好、结果可靠，是检测低丰度ACC活性的首选金标准，尤其适用于基础研究。缺点是需要特殊防护和废物处理。
  • 比色法：
    • NADPH偶联法： 可实现连续监测，适合动力学分析，但需要额外的昂贵偶联酶，且易受体系中干扰物影响。
    • 丙二酰辅酶A衍生化法： 无需特殊设备和同位素，成本较低，操作相对简单，可用于高通量筛选。缺点是灵敏度通常低于同位素法，衍生化步骤可能存在干扰（如某些代谢物也会与TBA反应）。
  • 应用场景： 基础代谢研究、药物筛选（作用于ACC的抑制剂）、疾病模型（如肥胖、糖尿病动物模型或细胞模型）中ACC活性变化评估、酶动力学研究、酶纯化过程中活性追踪等。
 

七、总结

乙酰辅酶A羧化酶活性检测是研究脂肪酸代谢调控的核心技术。放射性同位素法因其高灵敏度和准确性仍是研究的基石，而比色法则提供了更安全便捷的替代选择。研究者应根据实验目的、样本类型、设备条件和安全要求选择最合适的方法。严谨的实验设计、规范的操作流程和完备的对照设置是获得可靠ACC活性数据的关键。这些检测方法的应用将继续推动我们对代谢健康与疾病的认识。