脂氧合酶(LOX)活性检测

发布时间:2025-06-28 08:01:39 阅读量:3 作者:生物检测中心

脂氧合酶 (LOX) 活性检测方法

一、 概述
脂氧合酶 (Lipoxygenase, LOX, EC 1.13.11.12) 是一种广泛存在于植物、动物及微生物中的氧化还原酶。它催化含有一个或多个 (1Z,4Z)-戊二烯结构的多不饱和脂肪酸(如亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸)加氧反应,生成具有共轭双键的氢过氧化物。LOX 在植物的生长发育、防御反应、衰老以及食品风味形成、色泽变化(如大豆粉漂白)、油脂氧化酸败、哺乳动物炎症反应、信号传导等生理和病理过程中扮演关键角色。精确测定 LOX 活性对于基础生物化学研究、食品科学与工程(如大豆制品加工、果蔬保鲜)、医药研究(如炎症机制、药物筛选)等领域至关重要。

二、 检测原理
目前最常用的 LOX 活性检测方法是基于紫外分光光度法(UV Spectrophotometry),其核心原理在于:

  1. 底物转化: LOX 催化其典型底物亚油酸 (Linoleic acid),将其转化为 13(S)-氢过氧基-9Z,11E-十八碳二烯酸 (13-HPOD)。
  2. 特征吸收: 该反应产物 13-HPOD 分子结构中含有一个共轭二烯键 (-OOH-CH=CH-CH=CH-),该结构在紫外光区 234 nm 波长处具有强烈的特征吸收峰。
  3. 动力学监测: 在优化的反应体系中,于 234 nm 处连续监测吸光度 (A234) 随反应时间的变化。吸光度的上升速率直接反映了 LOX 催化底物生成含共轭二烯产物的速率,即酶活性。
  4. 定量依据: 根据 13-HPOD 在 234 nm 处的摩尔消光系数 (ε234 ≈ 25,000 L mol⁻¹ cm⁻¹),可将吸光度变化值换算成底物消耗量或产物生成量。
 

三、 主要试剂与材料

  • 底物储备液 (亚油酸): 精确称取适量亚油酸。由于亚油酸水溶性差,通常将其溶解于少量无水乙醇或甲醇中(终浓度建议 ≤ 5% v/v,避免高浓度有机溶剂抑制酶活),然后用碱性溶液(如 0.1 M NaOH)调节至澄清,形成亚油酸钠盐溶液。最后用反应缓冲液稀释至所需工作浓度(通常为 0.2 - 0.6 mM)。注意: 市售亚油酸可能含有氢过氧化物杂质,需纯化或选择高纯度产品。
  • 反应缓冲液: 常用硼酸钠-硼酸缓冲液 (pH 9.0, 0.1 M) 或磷酸钠缓冲液 (pH 6.8, 0.1 M),以满足不同来源 LOX 的最适 pH 要求(植物 LOX 常用 pH 9.0,部分来源如大豆 LOX-1 在 pH 9.0, LOX-2/3 在 pH 6.8;哺乳动物 LOX 多在近中性或弱碱性)。缓冲液浓度应保持恒定的离子强度。
  • 酶液: 待测样品(如组织匀浆上清液、细胞裂解液、纯化酶溶液等)。使用前宜用缓冲液适当稀释,确保反应初速度在线性范围内。建议冰浴保存,尽快测定。
  • 终止液: 用于终止反应以便准确测定终点。常用 0.1 M HCl(酸化至 pH ≤ 3.0)或含有抗氧化剂(如 10 mM 乙二胺四乙酸二钠 (EDTA), 0.01% 丁基化羟基甲苯 (BHT))的溶液。
  • 其他: 去离子水,用于清洗的溶剂(如乙醇),移液器及吸头,比色皿(石英或可透过紫外光的塑料比色皿,光程 1 cm)。
 

四、 操作步骤 (紫外分光光度法,动力学法)

  1. 仪器预热与校准: 开启紫外-可见分光光度计,预热至少 30 分钟。设定检测波长为 234 nm。用反应缓冲液(空白)调零。
  2. 底物-缓冲液混合液配制: 在比色皿或反应管中,加入预定体积的反应缓冲液和亚油酸底物工作液,轻轻混匀。将混合液置于仪器比色皿架中恒温(通常 25°C 或 30°C,取决于研究需求)平衡 2-3 分钟。记录此时的吸光度作为基线 (A₀)。
  3. 启动反应: 迅速加入预定体积的酶液(体积通常较小,如 10-50 μL),立即轻柔且充分混匀(避免产生气泡),同时启动计时器。
  4. 监测吸光度: 连续监测并记录 234 nm 处吸光度 (A234) 随时间的变化。通常监测 30-180 秒(或直到吸光度变化呈良好线性)。确保记录的是线性初速度阶段的吸光度变化。
  5. 终止反应 (可选,终点法时采用): 若采用终点法而非连续监测,则在反应进行预定时间 (t,如 1-5 分钟) 后,迅速加入终止液终止反应,充分混匀,然后测定 A234。
  6. 空白对照: 设置空白对照,以等体积缓冲液代替酶液加入底物-缓冲液混合液中,监测或测定其 A234 变化,用于校正非酶促氧化等因素引起的背景变化。
  7. 酶活性计算:
 

五、 酶活性计算

  1. 确定吸光度变化 (ΔA234/min):

    • 动力学法: 从记录的 A234-t 曲线中,选取线性良好的反应初速度阶段(通常是最初的 30-60 秒),计算每分钟吸光度的增加值 (ΔA234/min)。
    • 终点法: ΔA234 = A_sample(t) - A_sample(0) - [A_blank(t) - A_blank(0)]。再除以反应时间 (t, min),得到 ΔA234/min。
  2. 摩尔消光系数 (ε): 使用文献报道的 13-HPOD 在 234 nm 处的摩尔消光系数,通常取 25,000 L mol⁻¹ cm⁻¹(具体值可能略有差异,可根据标准品自行测定)。

  3. 体积换算: 考虑反应体系总体积 (V_t, mL) 和比色皿光程 (L, cm, 通常为 1 cm)。

  4. 酶活力单位 (U) 定义: 通常定义为一个酶活力单位 (Unit, U) 为在特定反应条件下(温度、pH),每分钟催化生成 1 微摩尔 (μmol) 产物 (13-HPOD) 所需的酶量。

  5. 活性计算公式:
    酶活性 (U/mL) = (ΔA234/min) * V_t * 1000 / (ε * L * V_e * t)

    • ΔA234/min:每分钟吸光度变化值(从线性初速度计算得出)
    • V_t:反应体系总体积 (mL)
    • 1000:将 mL 转换为 L 的系数 (因 ε 单位为 L mol⁻¹ cm⁻¹)
    • ε:13-HPOD 在 234 nm 的摩尔消光系数 (≈ 25,000 L mol⁻¹ cm⁻¹)
    • L:比色皿光程 (cm,通常为 1)
    • V_e:加入的反应体系中酶液的体积 (mL)
    • t:用于计算 ΔA234/min 的时间段 (min),通常为 1(即 ΔA234/min 已经代表了每分钟的变化)
     

    (注:若酶液经过稀释,需乘以稀释倍数换算原始样品活性;也可计算比活力 U/mg protein,需测定酶液中蛋白质浓度)

 

六、 关键注意事项

  1. 底物纯度与浓度: 亚油酸的纯度至关重要,避免氢过氧化物杂质干扰。底物浓度应达到或接近饱和(通常 K_m 值在 10⁻⁵ - 10⁻⁴ M 数量级),以确保测得的是最大反应速度 (V_max),常用 0.2-0.6 mM。
  2. 缓冲液 pH 与离子强度: 严格配制缓冲液,确保准确的最适 pH(不同来源 LOX 差异大)。保持离子强度一致,避免影响酶活。
  3. 温度控制: 反应体系需恒温(常用 25°C 或 30°C),温度波动影响反应速率。
  4. 酶液浓度与线性范围: 酶液浓度过高可能导致反应过快,超出线性初速度范围;过低则信号弱、误差大。需预实验确定合适的稀释倍数。
  5. 氧含量: LOX 是加氧酶,反应依赖于溶解氧。剧烈混合有助于氧溶解,但避免产生过多气泡干扰光路。长时间反应可能因氧耗竭使速率下降。
  6. 起始时机与混匀: 加入酶液后必须立即充分混匀并开始监测,获取真实的初速度。
  7. 背景干扰: 酶液或缓冲液中可能含有能吸收 234 nm 紫外光的物质(如核酸、芳香族氨基酸、污染物),空白对照必不可少。样品需适度澄清。
  8. 酶稳定性: LOX 易失活(尤其稀释后),样品制备和测定过程应在冰浴中进行并尽快完成。
  9. 仪器性能: 确保分光光度计波长准确、基线稳定、响应快速。
 

七、 应用与意义
精确测定 LOX 活性具有广泛的应用价值:

  • 基础研究: 阐明 LOX 在生物体(植物、动物、微生物)生长发育、胁迫响应、信号通路中的作用机制;研究酶动力学特性(Km, Vmax)、最适 pH/pH 稳定性、温度敏感性、抑制剂/激活剂效应等。
  • 食品科学与工程: 评估大豆、小麦、果蔬等原料及其加工产品(豆奶、面粉、果汁)中的 LOX 活性,研究其在食品色泽(漂白/褐变)、风味(产生醛酮等挥发性物质)、质构变化及油脂氧化酸败中的作用,指导工艺优化(如热烫灭酶控制大豆腥味)和保鲜技术开发。
  • 医药与生理学研究: 检测哺乳动物组织、细胞(如炎症细胞)中 LOX(5-LOX, 12-LOX, 15-LOX)活性,研究其在炎症性疾病(哮喘、关节炎、动脉粥样硬化)、癌症等病理过程中的作用,进行相关药物(LOX 抑制剂)的筛选与药效评价。
 

该方法因其原理清晰、操作相对简便、灵敏度较高、成本较低且易于实现自动化监测,已成为 LOX 活性检测的标准方法之一。严格遵守操作规程并注意关键影响因素,才能获得准确可靠的酶活性数据。