脂氧合酶 (LOX) 活性检测方法
一、 概述
脂氧合酶 (Lipoxygenase, LOX, EC 1.13.11.12) 是一种广泛存在于植物、动物及微生物中的氧化还原酶。它催化含有一个或多个 (1Z,4Z)-戊二烯结构的多不饱和脂肪酸（如亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸）加氧反应，生成具有共轭双键的氢过氧化物。LOX 在植物的生长发育、防御反应、衰老以及食品风味形成、色泽变化（如大豆粉漂白）、油脂氧化酸败、哺乳动物炎症反应、信号传导等生理和病理过程中扮演关键角色。精确测定 LOX 活性对于基础生物化学研究、食品科学与工程（如大豆制品加工、果蔬保鲜）、医药研究（如炎症机制、药物筛选）等领域至关重要。
二、 检测原理
目前最常用的 LOX 活性检测方法是基于紫外分光光度法（UV Spectrophotometry），其核心原理在于：
- 底物转化： LOX 催化其典型底物亚油酸 (Linoleic acid)，将其转化为 13(S)-氢过氧基-9Z,11E-十八碳二烯酸 (13-HPOD)。
- 特征吸收： 该反应产物 13-HPOD 分子结构中含有一个共轭二烯键 (-OOH-CH=CH-CH=CH-)，该结构在紫外光区 234 nm 波长处具有强烈的特征吸收峰。
- 动力学监测： 在优化的反应体系中，于 234 nm 处连续监测吸光度 (A234) 随反应时间的变化。吸光度的上升速率直接反映了 LOX 催化底物生成含共轭二烯产物的速率，即酶活性。
- 定量依据： 根据 13-HPOD 在 234 nm 处的摩尔消光系数 (ε234 ≈ 25,000 L mol⁻¹ cm⁻¹)，可将吸光度变化值换算成底物消耗量或产物生成量。
三、 主要试剂与材料
- 底物储备液 (亚油酸)： 精确称取适量亚油酸。由于亚油酸水溶性差，通常将其溶解于少量无水乙醇或甲醇中（终浓度建议 ≤ 5% v/v，避免高浓度有机溶剂抑制酶活），然后用碱性溶液（如 0.1 M NaOH）调节至澄清，形成亚油酸钠盐溶液。最后用反应缓冲液稀释至所需工作浓度（通常为 0.2 - 0.6 mM）。注意： 市售亚油酸可能含有氢过氧化物杂质，需纯化或选择高纯度产品。
- 反应缓冲液： 常用硼酸钠-硼酸缓冲液 (pH 9.0, 0.1 M) 或磷酸钠缓冲液 (pH 6.8, 0.1 M)，以满足不同来源 LOX 的最适 pH 要求（植物 LOX 常用 pH 9.0，部分来源如大豆 LOX-1 在 pH 9.0, LOX-2/3 在 pH 6.8；哺乳动物 LOX 多在近中性或弱碱性）。缓冲液浓度应保持恒定的离子强度。
- 酶液： 待测样品（如组织匀浆上清液、细胞裂解液、纯化酶溶液等）。使用前宜用缓冲液适当稀释，确保反应初速度在线性范围内。建议冰浴保存，尽快测定。
- 终止液： 用于终止反应以便准确测定终点。常用 0.1 M HCl（酸化至 pH ≤ 3.0）或含有抗氧化剂（如 10 mM 乙二胺四乙酸二钠 (EDTA), 0.01% 丁基化羟基甲苯 (BHT)）的溶液。
- 其他： 去离子水，用于清洗的溶剂（如乙醇），移液器及吸头，比色皿（石英或可透过紫外光的塑料比色皿，光程 1 cm）。
四、 操作步骤 (紫外分光光度法，动力学法)
- 仪器预热与校准： 开启紫外-可见分光光度计，预热至少 30 分钟。设定检测波长为 234 nm。用反应缓冲液（空白）调零。
- 底物-缓冲液混合液配制： 在比色皿或反应管中，加入预定体积的反应缓冲液和亚油酸底物工作液，轻轻混匀。将混合液置于仪器比色皿架中恒温（通常 25°C 或 30°C，取决于研究需求）平衡 2-3 分钟。记录此时的吸光度作为基线 (A₀)。
- 启动反应： 迅速加入预定体积的酶液（体积通常较小，如 10-50 μL），立即轻柔且充分混匀（避免产生气泡），同时启动计时器。
- 监测吸光度： 连续监测并记录 234 nm 处吸光度 (A234) 随时间的变化。通常监测 30-180 秒（或直到吸光度变化呈良好线性）。确保记录的是线性初速度阶段的吸光度变化。
- 终止反应 (可选，终点法时采用)： 若采用终点法而非连续监测，则在反应进行预定时间 (t，如 1-5 分钟) 后，迅速加入终止液终止反应，充分混匀，然后测定 A234。
- 空白对照： 设置空白对照，以等体积缓冲液代替酶液加入底物-缓冲液混合液中，监测或测定其 A234 变化，用于校正非酶促氧化等因素引起的背景变化。
- 酶活性计算：
五、 酶活性计算
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确定吸光度变化 (ΔA234/min)：
- 动力学法： 从记录的 A234-t 曲线中，选取线性良好的反应初速度阶段（通常是最初的 30-60 秒），计算每分钟吸光度的增加值 (ΔA234/min)。
- 终点法： ΔA234 = A_sample(t) - A_sample(0) - [A_blank(t) - A_blank(0)]。再除以反应时间 (t, min)，得到 ΔA234/min。
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摩尔消光系数 (ε)： 使用文献报道的 13-HPOD 在 234 nm 处的摩尔消光系数，通常取 25,000 L mol⁻¹ cm⁻¹（具体值可能略有差异，可根据标准品自行测定）。
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体积换算： 考虑反应体系总体积 (V_t, mL) 和比色皿光程 (L, cm, 通常为 1 cm)。
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酶活力单位 (U) 定义： 通常定义为一个酶活力单位 (Unit, U) 为在特定反应条件下（温度、pH），每分钟催化生成 1 微摩尔 (μmol) 产物 (13-HPOD) 所需的酶量。
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活性计算公式：
酶活性 (U/mL) = (ΔA234/min) * V_t * 1000 / (ε * L * V_e * t)ΔA234/min：每分钟吸光度变化值（从线性初速度计算得出）V_t：反应体系总体积 (mL)1000：将 mL 转换为 L 的系数 (因 ε 单位为 L mol⁻¹ cm⁻¹)ε：13-HPOD 在 234 nm 的摩尔消光系数 (≈ 25,000 L mol⁻¹ cm⁻¹)L：比色皿光程 (cm，通常为 1)V_e：加入的反应体系中酶液的体积 (mL)t：用于计算 ΔA234/min 的时间段 (min)，通常为 1（即 ΔA234/min 已经代表了每分钟的变化）
(注：若酶液经过稀释，需乘以稀释倍数换算原始样品活性；也可计算比活力 U/mg protein，需测定酶液中蛋白质浓度)。
六、 关键注意事项
- 底物纯度与浓度： 亚油酸的纯度至关重要，避免氢过氧化物杂质干扰。底物浓度应达到或接近饱和（通常 K_m 值在 10⁻⁵ - 10⁻⁴ M 数量级），以确保测得的是最大反应速度 (V_max)，常用 0.2-0.6 mM。
- 缓冲液 pH 与离子强度： 严格配制缓冲液，确保准确的最适 pH（不同来源 LOX 差异大）。保持离子强度一致，避免影响酶活。
- 温度控制： 反应体系需恒温（常用 25°C 或 30°C），温度波动影响反应速率。
- 酶液浓度与线性范围： 酶液浓度过高可能导致反应过快，超出线性初速度范围；过低则信号弱、误差大。需预实验确定合适的稀释倍数。
- 氧含量： LOX 是加氧酶，反应依赖于溶解氧。剧烈混合有助于氧溶解，但避免产生过多气泡干扰光路。长时间反应可能因氧耗竭使速率下降。
- 起始时机与混匀： 加入酶液后必须立即充分混匀并开始监测，获取真实的初速度。
- 背景干扰： 酶液或缓冲液中可能含有能吸收 234 nm 紫外光的物质（如核酸、芳香族氨基酸、污染物），空白对照必不可少。样品需适度澄清。
- 酶稳定性： LOX 易失活（尤其稀释后），样品制备和测定过程应在冰浴中进行并尽快完成。
- 仪器性能： 确保分光光度计波长准确、基线稳定、响应快速。
七、 应用与意义
精确测定 LOX 活性具有广泛的应用价值：
- 基础研究： 阐明 LOX 在生物体（植物、动物、微生物）生长发育、胁迫响应、信号通路中的作用机制；研究酶动力学特性（Km, Vmax）、最适 pH/pH 稳定性、温度敏感性、抑制剂/激活剂效应等。
- 食品科学与工程： 评估大豆、小麦、果蔬等原料及其加工产品（豆奶、面粉、果汁）中的 LOX 活性，研究其在食品色泽（漂白/褐变）、风味（产生醛酮等挥发性物质）、质构变化及油脂氧化酸败中的作用，指导工艺优化（如热烫灭酶控制大豆腥味）和保鲜技术开发。
- 医药与生理学研究： 检测哺乳动物组织、细胞（如炎症细胞）中 LOX（5-LOX, 12-LOX, 15-LOX）活性，研究其在炎症性疾病（哮喘、关节炎、动脉粥样硬化）、癌症等病理过程中的作用，进行相关药物（LOX 抑制剂）的筛选与药效评价。
该方法因其原理清晰、操作相对简便、灵敏度较高、成本较低且易于实现自动化监测，已成为 LOX 活性检测的标准方法之一。严格遵守操作规程并注意关键影响因素，才能获得准确可靠的酶活性数据。