游离胆固醇(FC)含量检测

发布时间:2025-06-28 08:01:39 阅读量:2 作者:生物检测中心

游离胆固醇(FC)含量检测:原理、方法与应用

游离胆固醇(Free Cholesterol, FC)是细胞膜和血浆脂蛋白中未酯化的胆固醇形式,在维持细胞膜结构、流动性及作为类固醇激素合成前体等方面发挥关键作用。准确测定生物样本(如血清、血浆、细胞、组织)中的FC含量,对于研究脂质代谢、评估心血管疾病风险、诊断遗传性脂质代谢紊乱(如Tangier病)以及监测降脂治疗效果具有重要意义。本检测方法基于酶学反应原理,具有特异性高、操作简便的特点。

一、 检测原理

本方法采用经典的酶比色法/荧光法测定游离胆固醇含量,核心反应如下:

  1. 胆固醇氧化酶反应: 游离胆固醇在胆固醇氧化酶(Cholesterol Oxidase) 催化下被氧化,生成胆甾-4-烯-3-酮(Cholest-4-en-3-one)过氧化氢(H₂O₂)

    • FC + O₂ → 胆甾-4-烯-3-酮 + H₂O₂
  2. 过氧化物酶反应: 生成的过氧化氢在过氧化物酶(Peroxidase, POD) 存在下,与特定的发色底物(显色剂) 反应,生成在特定波长下有强吸收(比色法)或能发射荧光(荧光法)的有色产物。

    • H₂O₂ + 显色剂 → 有色产物 + H₂O
 

通过测定有色产物在特定波长(如比色法常用500nm附近)的吸光度值(A),或荧光产物的荧光强度,并与已知浓度的FC标准品进行比较,即可计算出样本中FC的含量。

关键点: 该反应体系仅特异性检测游离胆固醇。总胆固醇(TC)的测定通常需要在反应体系中额外加入胆固醇酯酶(Cholesterol Esterase),先将胆固醇酯水解成游离胆固醇和游离脂肪酸,再进行上述氧化显色反应。FC检测则不加入胆固醇酯酶,确保仅检测未酯化的部分。

二、 主要检测方法

基于上述原理,常用的检测方法包括:

  1. 酶比色法: 最常用、经济的方法。发色底物通常为4-氨基安替比林(4-AAP)与酚类化合物(如苯酚、TOOS等)组成的Trinder试剂,反应生成红色醌亚胺染料,在500-550nm波长处有最大吸收。使用分光光度计检测吸光度。
  2. 酶荧光法: 灵敏度通常高于比色法。使用高灵敏度的荧光底物(如高香草酸、Amplex Red等),在过氧化物酶催化下生成强荧光产物。使用荧光分光光度计检测荧光强度(激发光/发射光波长根据底物确定,如Amplex Red常用Ex/Em: 530-560nm / 585-590nm)。
  3. 自动化分析仪法: 临床实验室广泛采用。原理同酶比色法,但操作在自动化生化分析仪上进行,实现高通量、标准化检测。
  4. 色谱法: 如高效液相色谱(HPLC)或气相色谱(GC),通常结合质谱(MS)。这类方法准确度高,可同时分离检测FC、CE及其他脂质,但设备昂贵、操作复杂、耗时长,多用于研究或参考方法实验室。
 

三、 操作流程概要(以酶比色法为例)

以下流程为通用描述,具体操作需严格参照所使用的检测试剂说明。

  1. 试剂制备: 按说明书配制工作试剂(通常含胆固醇氧化酶、过氧化物酶、显色剂、缓冲液、稳定剂等)。FC标准品溶液(系列浓度)。
  2. 样本处理:
    • 血清/血浆: 采集后尽快分离,避免溶血。可立即检测或于-20℃至-80℃冻存(避免反复冻融)。检测前恢复至室温,混匀。严重脂血样本需特殊处理。
    • 细胞/组织: 需进行脂质提取。常用氯仿-甲醇混合溶剂(如Folch法或Bligh & Dyer法)提取总脂质,将脂质提取物溶于适当溶剂(如异丙醇或含Triton X-100的缓冲液)后进行检测。确保提取过程不影响FC/CE比例。
  3. 加样与反应:
    • 在比色皿或微孔板中,按顺序加入:
      • 样本/标准品/空白(如生理盐水或缓冲液)
      • 酶工作试剂
    • 充分混匀。
    • 在37℃(或试剂指定温度)下避光孵育一定时间(通常30-60分钟),让反应充分进行。
  4. 吸光度测定: 使用分光光度计或酶标仪,在试剂指定的波长(如500nm或550nm)下测定各管(孔)的吸光度值(A)。
  5. 标准曲线绘制与计算:
    • 以FC标准品浓度为横坐标(X),其对应的吸光度值(A标准 - A空白)为纵坐标(Y),绘制标准曲线(通常为直线)。
    • 计算样本吸光度(A样本 - A空白)。
    • 根据样本吸光度值,从标准曲线上查出对应的FC浓度。
    • 考虑样本稀释倍数(如脂质提取过程),计算原始样本中FC含量。单位通常为mmol/L或mg/dL(血清/血浆),或µg/mg蛋白(细胞/组织)。
 

四、 临床意义与应用

  1. 脂质代谢研究: FC是胆固醇逆向转运过程(RCT)的关键组分,测定FC有助于理解RCT效率及胆固醇在细胞与血浆脂蛋白(如HDL)间的流动。
  2. 心血管疾病风险评估:
    • 虽然低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)是主要风险指标,但HDL颗粒中的FC含量及其组成比例(如FC/CE比值)也被认为与HDL功能及动脉粥样硬化风险相关。
    • 某些情况下(如使用特异性药物),单独监测FC变化可能提供额外信息。
  3. 遗传性脂质代谢紊乱诊断:
    • Tangier病: 由于ABCA1基因突变导致HDL严重缺乏,血浆中FC水平显著降低,而胆固醇酯在网状内皮系统蓄积。
    • 家族性卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)缺乏症: LCAT负责将FC酯化为CE。缺乏时血浆FC升高,CE降低,HDL结构异常。
  4. 药物疗效监测: 评估某些影响胆固醇吸收、合成或酯化过程的降脂药物的效果。
  5. 细胞生物学研究: 评估细胞膜胆固醇含量及其动态变化,研究胆固醇在信号转导、膜运输等过程中的作用。
 

五、 注意事项与质量控制

  1. 样本稳定性: FC相对稳定,但仍建议尽快检测。血清/血浆在4℃可存放数天,长期保存应于-20℃以下。避免反复冻融。
  2. 避免酯化/水解: 确保检测FC时不加入胆固醇酯酶。样本处理(如脂质提取)过程应快速、低温,尽量减少内源性酯酶或酰基转移酶活性造成的FC与CE间转化。
  3. 干扰因素:
    • 溶血: 红细胞释放的过氧化氢酶会消耗反应中的H₂O₂,导致结果假性偏低。严重溶血样本应避免使用。
    • 胆红素: 高浓度胆红素具有还原性,可能干扰Trinder反应,导致结果偏低。
    • 抗坏血酸: 强还原性物质,同样可能干扰显色反应。
    • 药物: 某些药物可能干扰酶活性或反应(需查阅具体试剂说明书)。
  4. 试剂与标准品: 使用合格的试剂。标准品应准确配制并妥善保存。注意酶试剂的活性有效期。
  5. 质量控制:
    • 空白管/孔: 每次检测必须设置试剂空白。
    • 标准曲线: 每次检测都应包含系列标准品,绘制标准曲线。线性相关系数(R²)应大于0.99。
    • 质控品: 使用已知浓度的定值质控血清或质控品,监控检测系统的准确度和精密度。
  6. 精密度: 批内和批间变异系数(CV%)应符合实验室或方法要求(通常CV% < 5%为佳)。
  7. 方法选择: 根据样本类型(血浆/细胞/组织)、通量需求和灵敏度要求选择合适的检测方法(比色法、荧光法、色谱法等)。
 

结论

游离胆固醇含量检测是脂质代谢研究和临床诊断的重要工具。基于胆固醇氧化酶-过氧化物酶体系的酶比色法/荧光法因其特异性好、操作相对简便、成本适中等优点,成为广泛应用的方法。严格遵守操作规程、注意样本处理和干扰因素、实施有效的质量控制措施,是获得准确可靠FC检测结果的关键。检测结果应结合临床背景和其他脂质参数(如TC、TG、HDL-C、LDL-C)进行综合分析和解读。