β-葡萄糖醛酸苷酶(β-GD)活性检测

发布时间：2025-06-28 08:01:39 阅读量：1 作者：生物检测中心

β-葡萄糖醛酸苷酶(β-GD)活性检测方法

一、 背景与意义
β-葡萄糖醛酸苷酶（β-Glucuronidase， β-GD， EC 3.2.1.31）是一种重要的溶酶体水解酶。其主要功能是催化水解葡糖醛酸苷类化合物（如糖苷、糖脂、类固醇葡糖醛酸苷等）末端的β-葡糖醛酸残基，在糖复合物的降解、胆红素代谢、类固醇激素代谢、外源性物质（如药物、毒素）的解毒和再活化过程中扮演关键角色。该酶活性异常与多种肝脏疾病、肾脏疾病、某些肿瘤的发生发展及炎症过程密切相关。准确检测组织、细胞或体液样本（如血清、尿液）中的β-GD活性，对于基础医学研究、疾病诊断与病理机制探讨具有重要意义。

二、 检测原理
本方法采用比色法，以人工合成底物对硝基苯酚-β-D-葡萄糖醛酸苷 (p-Nitrophenyl β-D-glucuronide， pNPG) 进行检测。

  1. 酶促反应： β-GD催化pNPG水解，释放出游离的对硝基苯酚 (p-Nitrophenol， pNP) 和葡糖醛酸。
    pNPG + H₂O → pNP + D-Glucuronic Acid
  2. 显色反应： 反应终止后（通常加入碱性溶液如碳酸钠），在碱性条件下，水解产生的黄色产物pNP发生离子化，呈现稳定的黄色。
  3. 定量测定： 在波长405 nm处，使用紫外可见分光光度计测定黄色产物pNP的吸光度值。pNP的量与吸光度值在一定范围内呈良好的线性关系，从而间接反映β-GD的活性。酶活性单位定义为在特定条件下每分钟催化产生1 μmol pNP所需的酶量。
 

三、 所需材料与试剂

  1. 缓冲液： 0.1 M 醋酸钠缓冲液（含0.1% Triton X-100）， pH 4.8（或其他优化pH值，常在4.5-5.5范围内）。
    • 配制：
      • 0.1 M 醋酸钠溶液：称取无水醋酸钠8.2 g，用蒸馏水溶解并定容至1000 mL。
      • 0.1 M 醋酸溶液：取冰醋酸5.7 mL，用蒸馏水稀释至1000 mL。
      • 将醋酸钠溶液与醋酸溶液按适当比例混合，用pH计调节至pH 4.8。
      • 加入1 g/L (0.1%) Triton X-100（或其他非离子型去垢剂），溶解混匀。此缓冲液可4℃储存。
  2. 底物溶液： 10 mM pNPG溶液（溶于上述醋酸钠缓冲液中）。
    • 配制：准确称取pNPG（分子量约为316.25）。用预热至37℃的醋酸钠缓冲液溶解并定容至所需体积（通常配制成10 mL或20 mL）。此溶液需临用新配或分装后-20℃避光保存，避免反复冻融。
  3. 反应终止液： 0.2 M 碳酸钠溶液（Na₂CO₃）。
    • 配制：称取无水碳酸钠21.2 g，用蒸馏水溶解并定容至1000 mL。室温储存。
  4. 标准品： 10 mM 对硝基苯酚 (pNP) 标准贮备液（溶于蒸馏水）。临用前用蒸馏水稀释成系列浓度（如0, 20, 40, 60, 80, 100 μM）的标准工作液。
  5. 样本：
    • 组织样本： 取适量组织（如肝脏、肾脏、肿瘤组织），用预冷的生理盐水或缓冲液漂洗，去除血液及结缔组织，吸干水分，称重。加入适量预冷的0.1 M醋酸钠缓冲液（pH 4.8，含0.1% Triton X-100）（如按1：9 w/v），在冰浴条件下用组织匀浆器充分匀浆。将匀浆液于4℃下离心（如10,000-15,000 g, 20-30分钟），取上清液作为待测样本。临用前可用缓冲液适当稀释。
    • 细胞样本： 收集细胞，用预冷的PBS洗涤。离心弃上清。加入适量预冷的0.1 M醋酸钠缓冲液（pH 4.8，含0.1% Triton X-100），冰上裂解细胞（如用超声波破碎仪或反复冻融）。将裂解液于4℃下离心（如10,000-15,000 g, 10-15分钟），取上清液作为待测样本。测蛋白浓度后适当稀释。
    • 体液样本： 如血清、尿液等，可直接或经适当稀释后测定。尿液常需先透析去除内源性抑制剂。
  6. 其他： 恒温水浴锅（37℃）、紫外可见分光光度计、计时器、移液器及枪头、试管或微孔板（96孔板）、冰盒、离心机。
 

四、 检测步骤（试管法示例）

  1. 标准曲线制备（测定前进行）：

    • 取一系列试管，分别加入不同浓度的pNP标准工作液（如0, 20, 40, 60, 80, 100 μM）适量（如50 μL）。
    • 向每管中加入醋酸钠缓冲液（空白管加入100 μL，其他管加入50 μL），使总体积为150 μL（需与样品管反应终止前总体积一致）。
    • 立即向各管中加入450 μL 0.2 M 碳酸钠溶液（总体积600 μL），混匀。
    • 在405 nm波长下，以0 μM管（含缓冲液和碳酸钠）调零，测定各标准管的吸光度值（A405）。
    • 以pNP浓度为横坐标（μM），对应的A405值为纵坐标，绘制标准曲线，并获得线性回归方程（y = kx + b）。

  2. 样品测定：

    • 按下表在试管中加入试剂（单位：μL）：

      管号 类型 样本/缓冲液 底物溶液 终止液 作用
      1 样品测定管 (S) 样本上清液 50 100 - 酶促反应
      2 样品空白管 (SB) 样本上清液 50 - 450 样本底色
      3 反应空白管 (RB) 醋酸钠缓冲液 50 100 - 底物自水解

    • 37℃预温育： 将底物溶液和装有缓冲液/样本的试管置于37℃水浴中预温育5-10分钟。（此步可省略，但预温育可使结果更稳定）。

    • 启动反应：

      • 向样品测定管(S)和反应空白管(RB)中迅速加入100 μL预温的底物溶液，立即混匀并开始计时。
      • 样品空白管(SB) 此时加入100 μL醋酸钠缓冲液（而非底物）和450 μL终止液（见下一步终止操作），混匀。注意： 样品空白管(SB)一般不需孵育，因为目的是消除样本本身在405nm的背景吸收。

    • 37℃孵育反应： 将样品测定管(S)和反应空白管(RB)精确置于37℃水浴中孵育预定时间（通常选择60分钟，或根据预实验确定使吸光度变化在0.1-1.0之间的合适时间T，单位：分钟）。

    • 终止反应： 孵育时间到达后：

      • 迅速向样品测定管(S)和反应空白管(RB)中加入450 μL预冷的0.2 M碳酸钠溶液，立即混匀以终止酶反应。
      • 样品空白管(SB) 已在之前加入终止液。

    • 测定吸光度： 室温放置5-10分钟使颜色稳定（或在405 nm处吸光度不再上升）。在波长405 nm处，以蒸馏水或反应空白管(RB)调零（扣除底物自水解及缓冲液背景），分别读取样品测定管(S)和样品空白管(SB)的吸光度值。

 

五、 结果计算

  1. 计算净吸光度： ΔA₄₀₅ = A₄₀₅(S) - A₄₀₅(SB)
    • A₄₀₅(S)：样品测定管的吸光度。
    • A₄₀₅(SB)：样品空白管的吸光度（扣除样本底色）。
    • 注：反应空白管(RB)用于调零，其值已包含在基线中。
  2. 计算pNP生成量： 根据标准曲线或回归方程(y=kx+b)，将净吸光度值ΔA₄₀₅代入，计算出反应体系中生成的pNP浓度（μM）。假设反应终止后总体积为Vt μL（示例中为600 μL），则生成的pNP摩尔数为：
    生成 pNP (nmol) = [计算出的 pNP 浓度 (μM， 即 μmol/L)] * (Vt / 1000) mL
    • 示例（Vt=600 μL）： 生成 pNP (nmol) = [pNP] (μM) * 0.6
  3. 计算酶活性：

    • 活性定义： 在上述测定条件下（37℃， pH 4.8），每分钟催化产生1 μmol pNP所需的酶量定义为一个酶活性单位（U）。

    • 计算：
      β-GD 活性 (U/mL) = [生成 pNP (nmol) / (反应时间 T (min) * 1000)] * (1 / 样本体积 V_s (mL)) * 样本稀释倍数
      β-GD 活性 (U/g tissue) = [生成 pNP (nmol) / (反应时间 T (min) * 1000)] * (1 / 组织重量 W (g)) * (匀浆体积 V_h (mL) / 反应中样本体积 V_s (mL)) * 匀浆稀释倍数
      β-GD 活性 (U/mg prot) = [生成 pNP (nmol) / (反应时间 T (min) * 1000)] * (1 / 反应中样本蛋白量 P (mg)) * 样本稀释倍数

    • 公式说明：

      • 生成 pNP (nmol) / 1000: 将nmole转换为μmole (1 μmol = 1000 nmol)。
      • 1 / (反应时间 T (min)): 得到每分钟产生的μmole数。
      • 1 / 样本体积 V_s (mL): 得到每毫升样本的活性（U/mL）。
      • 1 / 组织重量 W (g): 得到每克组织的活性（U/g）。
      • 匀浆体积 V_h (mL) / 反应中样本体积 V_s (mL): 将反应中样本体积换算回原始匀浆体积。
      • 1 / 反应中样本蛋白量 P (mg): 得到每毫克蛋白的活性（U/mg prot）。
      • 样本稀释倍数：如果在反应前样本进行了额外稀释，需要乘上该倍数。
 

六、 注意事项

  1. pH值： β-GD最适pH通常在4.5-5.5之间，pH 4.8是常用值。务必精确配制和校准缓冲液pH值，其对酶活性影响极大。
  2. 温度控制： 酶促反应对温度敏感。水浴温度需精确维持在37±0.5℃，反应时间需严格控制。
  3. 反应线性： 必须确保在选定的反应时间内（如60分钟），酶促反应处于线性期（即酶促反应速率恒定，产物生成量与时间成正比）。若吸光度值过高（>1.0）或过低（<0.1），需相应缩短或延长反应时间，或调整样本浓度（稀释或浓缩）。
  4. 样本处理： 制备组织匀浆或细胞裂解液时需在冰浴中进行，低温离心，以尽量减少酶失活。样本上清液应尽快测定，或分装后-70℃以下冻存，避免反复冻融。测定前需平衡至室温。
  5. 样本量与稀释： 样本加入量需确保最终吸光度值落在标准曲线线性范围内。对于活性过高或过低的样本，应进行预实验确定合适的稀释倍数后再进行正式测定。
  6. 底物浓度： 10 mM pNPG通常是饱和或接近饱和浓度。底物溶液应新鲜配制或避免反复冻融降解。
  7. 干扰物质：
    • 某些样本（尤其是体液）可能含有内源性抑制物（如糖醛酸、葡糖二酸1,4-内酯）或增强剂。尿液样本常需透析处理。
    • 肝素抗凝剂可能会轻微抑制酶活性，EDTA或柠檬酸盐抗凝剂影响相对较小。
    • 样本中过高的血红蛋白、胆红素等色素可能干扰405 nm处的吸光度测定，需设置样品空白扣除。
  8. 底物空白： 必须设置反应空白管（RB）以扣除底物自身在碱性条件下可能产生的微弱颜色（自水解）及缓冲液背景。
  9. 样品空白： 设置样品空白管（SB）对于消除样本本身在测定波长下的背景吸收（如溶血、黄疸等）至关重要。
  10. 比色杯/微孔板： 确保比色杯或微孔板清洁，无残留物干扰吸光度测定。使用微孔板法时注意边缘效应。
  11. 单位换算： 注意计算过程中单位的统一和转换（如nmole到μmole， mL到L， g到mg等）。
  12. 质量控制： 建议每次检测时使用阳性对照（如已知活性的标准酶或高活性样本）以验证方法的稳定性和可靠性。
 

七、 总结
本方法描述的基于pNPG水解的比色法检测β-葡萄糖醛酸苷酶活性，原理明确，操作相对简便，成本较低，灵敏度可满足大多数科研实验要求。通过严格执行标准操作流程（SOP），精确控制关键变量（pH、温度、时间），并设置必要的空白对照，可以获得准确可靠的β-GD活性数据。该数据对于研究β-GD在生理病理过程中的作用、评估疾病状态及药物干预效果等具有重要价值。研究人员应根据具体样品类型（组织、细胞、体液）和研究目的，对样本处理和稀释步骤等进行必要的优化。