以下是关于β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-glucanase, β-1,3-GA)活性检测的完整实验方案,内容严格避免涉及任何企业或商品名称,仅描述科学方法与通用试剂:
β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-GA)活性检测方法
一、检测原理
β-1,3-葡聚糖酶催化β-1,3-葡聚糖(如昆布多糖)的水解,生成还原性糖(主要为葡萄糖)。通过3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定反应释放的还原糖量,计算酶活性单位(以单位时间内生成1 μmol还原糖所需的酶量为1个活力单位)。
二、试剂与材料
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底物溶液(1%,w/v):
溶解1.0 g昆布多糖(Laminarin,来源于海带)于100 mL 0.05 M醋酸钠缓冲液(pH 5.0)中,60℃水浴助溶,冷却至室温备用。 -
DNS显色剂:
溶解1.0 g 3,5-二硝基水杨酸、20 mL 2 M NaOH、30 g酒石酸钾钠于50 mL水中,加热搅拌溶解。冷却后加水定容至100 mL,避光保存。 -
0.05 M醋酸钠缓冲液(pH 5.0):
称取4.1 g无水醋酸钠,溶于900 mL水,用冰醋酸调pH至5.0,定容至1 L。 -
葡萄糖标准溶液(1 mg/mL):
精确称取100 mg无水葡萄糖,溶于水中并定容至100 mL。 -
终止液:
1 M NaOH溶液。
三、标准曲线制备
- 将葡萄糖标准溶液稀释至0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL浓度梯度。
- 取各浓度溶液1.0 mL,加入1.0 mL DNS试剂,沸水浴5 min后迅速冷却。
- 加水补至5 mL,于540 nm波长测定吸光度(OD值)。
- 以葡萄糖含量(μg)为横坐标,OD值为纵坐标,绘制标准曲线。
四、酶活性检测步骤
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酶液制备:
样品(植物组织、微生物发酵液等)用预冷的0.05 M醋酸钠缓冲液(pH 5.0)提取,离心(10,000 ×g, 4℃, 15 min),取上清液作为粗酶液。必要时稀释至适当浓度。 -
酶促反应:
取0.5 mL酶液 + 0.5 mL底物溶液(预温至40℃),涡旋混匀后立即于40℃水浴精确反应30 min。
对照管:0.5 mL酶液 + 0.5 mL缓冲液(灭活酶或后加底物)。 -
终止反应:
加入0.5 mL 1 M NaOH终止反应。 -
还原糖测定:
取1.0 mL反应液 + 1.0 mL DNS试剂,沸水浴5 min,冰水冷却后加水至5 mL,混匀测定540 nm OD值。
五、活性计算
- 根据标准曲线将OD值换算为还原糖生成量(μg)。
- 酶活性(U/mL)计算公式:
< data-sourcepos="null:null-null:null" xmlns="http://www.w3.org/1998/Math/MathML"> >酶活性 = ( C sample − C control ) × V total × N 0.18 × t × V enzyme \text{酶活性} = \frac{(C_{\text{sample}} - C_{\text{control}}) \times V_{\text{total}} \times N}{0.18 \times t \times V_{\text{enzyme}}} - < data-sourcepos="null:null-null:null" xmlns="http://www.w3.org/1998/Math/MathML">
>:样品管葡萄糖生成量(μg)C sample C_{\text{sample}} - < data-sourcepos="null:null-null:null" xmlns="http://www.w3.org/1998/Math/MathML">
>:对照管葡萄糖生成量(μg)C control C_{\text{control}} - < data-sourcepos="null:null-null:null" xmlns="http://www.w3.org/1998/Math/MathML">
>:反应体系总体积(mL,本方案为1.0 mL)V total V_{\text{total}} - < data-sourcepos="null:null-null:null" xmlns="http://www.w3.org/1998/Math/MathML">
>:酶液稀释倍数N N - < data-sourcepos="null:null-null:null" xmlns="http://www.w3.org/1998/Math/MathML">
>:反应时间(min)t t - < data-sourcepos="null:null-null:null" xmlns="http://www.w3.org/1998/Math/MathML">
>:反应体系中酶液体积(mL)V enzyme V_{\text{enzyme}} - 0.18:1 μmol葡萄糖质量(μg)(葡萄糖分子量180 Da)
- < data-sourcepos="null:null-null:null" xmlns="http://www.w3.org/1998/Math/MathML">
比活力(U/mg蛋白):需额外测定酶液蛋白浓度(如Bradford法),以总酶活除以总蛋白量。
六、注意事项
- 干扰排除:
- 若样品含内源还原糖,对照管需先加NaOH灭活酶,再加底物反应。
- 多糖类杂质可通过透析(截留分子量3,500 Da)去除。
- 酚类物质干扰可加入PVPP(交联聚乙烯吡咯烷酮)吸附。
- 反应线性验证:
确保反应时间与酶量在测定范围内符合一级动力学(还原糖生成量与时间呈线性)。 - 底物特异性:
昆布多糖(β-1,3-葡聚糖)可能含少量β-1,6键,建议使用高纯度底物。 - 叠氮化钠防腐:
长期保存试剂可加入0.02%叠氮化钠(剧毒,操作谨慎)。
七、方法学验证
- 重复性:同一酶液3次重复测定,RSD ≤ 5%。
- 准确性:添加标准葡萄糖回收率应在95–105%范围内。
- 检测限:以OD值高于空白3倍标准差计,通常为0.5–1.0 U/mL。
此方案基于经典DNS法建立,适用于实验室常规检测。如需更高灵敏度,可改用Nelson-Somogyi法或荧光标记底物法,但需相应调整设备与试剂。
参考文献依据:
Miller, G.L. (1959) Analytical Chemistry, 31: 426–428. (DNS法原理)
Pan, S. et al. (1991) Physiological and Molecular Plant Pathology, 39: 123–134. (植物β-1,3-葡聚糖酶检测应用)