海藻糖酶活性检测

发布时间：2025-06-28 08:01:39 阅读量：1 作者：生物检测中心

海藻糖酶活性检测方法

一、 引言
海藻糖酶广泛存在于微生物、植物和动物体内，专一性催化海藻糖水解为两分子葡萄糖。该酶活性与生物体的能量代谢、胁迫响应及某些病理过程（如昆虫消化、微生物代谢）密切相关，准确检测其活性在基础研究（如酶学性质表征、代谢途径解析）和实际应用（如功能食品开发、病虫害防控）中均具有重要意义。本方法基于广泛采用的还原糖测定原理，描述一种操作简便、结果可靠的海藻糖酶活性体外检测方案。

二、 检测原理
海藻糖酶催化水解反应如下：
海藻糖 + H₂O → 2葡萄糖
通过定量测定在一定反应条件下（特定温度、pH、时间），单位时间内酶促反应产生的还原糖（葡萄糖）量，即可计算海藻糖酶的活性。还原糖的测定采用3,5-二硝基水杨酸法：还原糖在碱性条件下加热，可将黄色的3,5-二硝基水杨酸还原成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。此产物在540nm波长处具有特征吸收峰，其吸光度值与还原糖浓度在一定范围内呈良好的线性关系。通过测定反应产物的吸光度，并与葡萄糖标准曲线比对，即可计算出产生的还原糖量，进而求得酶活力。

三、 试剂与材料

  1. 底物溶液 (0.1M 海藻糖)： 准确称取海藻糖溶于适量蒸馏水中，定容至所需体积。可加热助溶。临用前配制或分装保存于-20℃。
  2. 缓冲液 (0.05M, pH X.X)： 根据目标酶的最适pH选择合适缓冲体系（如醋酸钠缓冲液 pH 5.0-5.5 适用于多数真菌/酵母酶；磷酸盐缓冲液 pH 6.5-7.5 适用于部分细菌/哺乳动物酶），准确配制所需浓度。使用pH计校准pH值。
  3. 3,5-二硝基水杨酸显色剂 (DNS试剂)：
    • 称取酒石酸钾钠溶于适量蒸馏水。
    • 加入3,5-二硝基水杨酸。
    • 缓慢加入氢氧化钠溶液（可产生放热）。
    • 加入结晶酚和亚硫酸钠。
    • 搅拌至固体完全溶解（必要时可45℃水浴助溶），冷却后定容。
    • 储存于棕色瓶中，避光保存（室温下有效期约1个月）。
  4. 葡萄糖标准溶液 (1 mg/mL)： 准确称取无水葡萄糖溶于蒸馏水，定容。作为贮备液。临用前稀释成所需浓度梯度（如 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mg/mL）用于制作标准曲线。
  5. 反应终止液 (可选)： 根据检测规模，可选择加入特定体积DNS试剂本身作为终止剂（兼显色），或使用碳酸钠溶液（如2M）等碱性溶液终止反应后立即混匀进行显色。
  6. 待测酶液： 将含有海藻糖酶的样品（如粗酶提取液、纯化酶液、微生物培养上清液、组织匀浆上清液等）用相应缓冲液适当稀释，确保测得的吸光度值在标准曲线的线性范围内。
  7. 蒸馏水或去离子水
  8. 实验器材： 恒温水浴锅、分光光度计、移液器及枪头、计时器、试管或微孔板、涡旋振荡器、冰盒。
 

四、 操作步骤

(一) 葡萄糖标准曲线制作

  1. 取数支干净试管，按预设浓度梯度（如0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mg/mL）分别加入相应体积的葡萄糖标准溶液。
  2. 每管补加相应缓冲液至一定体积（如0.5 mL）。
  3. 每管加入一定体积（如0.5 mL）DNS显色剂，充分混匀。
  4. 将试管置沸水浴中准确加热5分钟。
  5. 立即取出试管，冷水浴冷却至室温。
  6. 加入一定体积蒸馏水稀释（如4.0 mL），再次充分混匀。
  7. 在540nm波长下，以“0”浓度管为空白对照，测定各管吸光度值。
  8. 以葡萄糖浓度（mg/mL）为横坐标（X），吸光度值（A540）为纵坐标（Y），绘制标准曲线，并得到线性回归方程 Y = aX + b (通常R² > 0.99)。
 

(二) 酶促反应与活性测定

  1. 预温育： 将底物溶液（0.1M海藻糖，溶于缓冲液）和稀释好的待测酶液置于恒温水浴（推荐37℃）中平衡10-15分钟。
  2. 启动反应：
    • 方案A (试管法)：
      • 取预热的空白管：加入一定体积（如0.5 mL）预热的底物溶液 + 一定体积（如0.4 mL）缓冲液 → 立即加入一定体积（如0.1 mL）DNS试剂 → 混匀（此时酶未加入，反应未启动，此为空白对照）。
      • 取预热的样品管：加入一定体积（如0.5 mL）预热的底物溶液 + 一定体积（如0.4 mL）缓冲液 → 迅速加入一定体积（如0.1 mL）预热的待测酶液 → 立即启动计时 → 混匀 → 精确反应一定时间（如10或15分钟，需预实验确定线性范围）。
      • 反应结束时，立即加入与空白管相同体积（如0.1 mL）DNS试剂 → 快速混匀以终止反应。
    • 方案B (微孔板/连续加样法)：
      • 在孔中加入一定体积（如50 μL）预热的底物溶液。
      • 加入一定体积（如40 μL）缓冲液。
      • 加入一定体积（如10 μL）预热的待测酶液 → 立即启动计时 → 混匀（可用板式振荡器）。
      • 精确反应一定时间（如10分钟）后，迅速加入一定体积（如100 μL）预热的DNS试剂 → 快速混匀以终止反应。
      • 空白对照孔：用缓冲液或灭活酶液代替酶液，其余步骤相同。
  3. 显色与测定：
    • 将所有终止反应后的反应管/反应孔（含空白和样品）置沸水浴中准确加热5分钟。
    • 取出后冷水浴冷却至室温。
    • 加入适量蒸馏水（试管法通常加4.0 mL，微孔板法根据体积调整）稀释并充分混匀/振荡。
    • 在540nm波长下，以空白对照管/孔的溶液调零，测定各样品管/孔的吸光度值 (A<sub>样品</sub>)。
 

五、 数据处理与酶活计算

  1. 计算还原糖生成量：
    • 根据测得的样品吸光度(A<sub>样品</sub>)，代入葡萄糖标准曲线方程 Y = aX + b，求得反应液中还原糖的浓度 (C<sub>还原糖</sub>, mg/mL)。
    • 计算实际反应体系中产生的还原糖量：
      还原糖量 (mg) = C<sub>还原糖</sub> (mg/mL) × 反应终止后混合液总体积 (mL)
      • 试管方案A示例： 若反应终止后总体积为 0.5mL (底物) + 0.4mL (缓冲液) + 0.1mL (酶) + 0.1mL (DNS) = 1.1mL （未计入后续稀释水），则计算时用C<sub>还原糖</sub>乘以1.1mL。后续稀释水用于比色，其体积在标准曲线制作时已同步考虑。
  2. 计算酶活性单位：
    • 定义：在测定条件下（特定温度、pH），每分钟催化产生1 μmol葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单位 (U)。
    • 计算公式：
      酶活性 (U/mL) = [ (还原糖量 (mg) × 1000 / 180.16) / 反应时间 (min) ] / 反应体系中酶液体积 (mL) × 1000
    • 公式分解：
      • 还原糖量(mg) × 1000： 将mg转换为μg。
      • / 180.16： 葡萄糖分子量，将μg葡萄糖转换为μmol葡萄糖 (因为 1 μmol葡萄糖 = 180.16 μg)。
      • / 反应时间(min)： 得到每分钟产生的葡萄糖微摩尔数 (μmol/min)。
      • / 反应体系中酶液体积(mL)： 得到每毫升酶液每分钟产生的葡萄糖微摩尔数 (μmol/min/mL)。
      • × 1000： 单位换算 (可选)：如果原始酶液稀释倍数较大，或希望得到更常用的U/mL，乘以1000将结果表示为标准单位 (μmol/min/mL = U/mL)。 注：有时也直接用 μmol/min/mL 表示，含义等同于 U/mL。
    • 示例计算 (方案B)：
      • 反应条件：酶液体积10μL (0.01 mL)，反应时间10 min。
      • 测得A<sub>样品</sub> = 0.450。
      • 标准曲线方程：A = 0.876 * C (mg/mL) + 0.012 (R²=0.998)。
      • 代入：0.450 = 0.876 * C + 0.012 → C = (0.450 - 0.012) / 0.876 ≈ 0.500 mg/mL。
      • 终止后混合液总体积 = 50μL (底物) + 40μL (缓冲液) + 10μL (酶) + 100μL (DNS) = 200 μL = 0.2 mL。
      • 还原糖量 = 0.500 mg/mL * 0.2 mL = 0.100 mg。
      • μmol葡萄糖 = (0.100 mg * 1000 μg/mg) / 180.16 μg/μmol ≈ 0.555 μmol。
      • 反应速率 = 0.555 μmol / 10 min = 0.0555 μmol/min。
      • 酶活性 = 0.0555 μmol/min / 0.01 mL = 5.55 μmol/min/mL = 5.55 U/mL。
 

六、 注意事项

  1. 温度控制： 恒温水浴温度必须精确稳定，预温育要充分，确保反应启动时体系温度一致。
  2. 反应时间： 反应时间需在线性范围内选择（通过预实验确定），确保产物生成量与时间成正比（通常选择初始速率期，如吸光度增长在0.2-0.8之间，时间5-20分钟）。
  3. 加样顺序与混匀： 启动反应时，加酶速度要快，并立即充分混匀。终止反应时加入DNS试剂的速度和混匀程度也要一致，以保证反应时间精确。
  4. 显色条件： 沸水浴显色时间务必准确（5 min），冷却后尽快测定吸光度，避免放置过久颜色衰减或沉淀。
  5. 酶液稀释： 待测酶液浓度应调整到使其反应后的吸光度值落在标准曲线的线性中段（通常0.2-0.8）。过高需稀释，过低需浓缩或增加酶量/延长反应时间（仍须在线性范围内）。
  6. 空白对照： 空白对照至关重要，用于扣除底物、试剂本身及背景干扰。必须与样品平行操作（尤其注意加DNS的时机）。
  7. DNS试剂稳定性： DNS试剂久置后颜色可能加深或产生沉淀，影响基线。建议定期更换或重新配制，并在标准曲线制作时同步使用新配试剂。
  8. 安全： DNS试剂含有浓碱和酚，配制和使用时需戴手套，避免接触皮肤和眼睛。沸水浴操作注意防烫。
  9. 重复性： 建议每个样品设置至少2-3个平行管/孔，取平均值计算。
 

七、 方法评价与局限性

  • 优点： 原理成熟、操作相对简便、成本较低、灵敏度较高（可检测较低酶活）、无需特殊昂贵设备（只需分光光度计）。
  • 局限性：
    • DNS法对还原糖并非完全特异，样品中如有其他还原性物质会产生干扰。
    • 显色反应本身也会消耗部分还原糖。
    • 反应终止时需要高温处理，可能对某些热不稳定酶的后续分析不利（纯检测活性一般无影响）。
    • 线性范围有限（通常葡萄糖浓度0.2-1.5 mg/mL对应的吸光度值线性较好）。
 

结论
本方法基于海藻糖酶水解底物产生还原糖（葡萄糖）的特性，利用DNS显色法对还原糖进行定量，进而计算出酶活性。该方法步骤清晰，材料易得，结果可靠，适用于实验室常规检测海藻糖酶活性。实际操作中需严格注意关键操作要点（温度、时间、加样混匀、空白设置）以保证数据的准确性和重复性。根据具体研究对象的特性（如pH、温度最适条件），可对缓冲液种类、浓度、pH值以及反应温度进行相应调整。