纤维素酶(CL)活性检测

发布时间：2025-06-28 08:01:39 阅读量：2 作者：生物检测中心

纤维素酶(CL)活性检测

纤维素酶（Cellulase, CL）是一类能够水解纤维素中β-1,4-糖苷键，最终将其降解为葡萄糖的复合酶系的总称。它主要由三类水解酶协同作用：内切葡聚糖酶（Endo-1,4-β-glucanase, EC 3.2.1.4）、外切葡聚糖酶或纤维二糖水解酶（Exo-1,4-β-glucanase/Cellobiohydrolase, EC 3.2.1.91）和β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase, EC 3.2.1.21）。纤维素酶活性检测是评价酶制剂性能、优化生产工艺及研究酶学特性的核心环节。

一、 检测原理

纤维素酶活性的测定主要基于检测其水解特定纤维素底物后产生的还原糖（主要是葡萄糖） 的量。依据反应终止方式和检测对象差异，常用方法可分为：

  1. 测还原糖法：

    • DNS法 (3,5-二硝基水杨酸法)： 这是最经典、应用最广泛的方法。其原理是纤维素酶作用于底物后生成的还原糖，在碱性条件下加热能将DNS试剂中的硝基还原成氨基，生成红棕色的氨基化合物（3-氨基-5-硝基水杨酸）。该化合物在540 nm波长处有最大光吸收，其吸光度值与还原糖含量成正比。通过测定吸光度值，对照葡萄糖标准曲线，即可计算出酶解产生的还原糖量，进而计算酶活力。
    • Somogyi-Nelson法： 生成的还原糖（葡萄糖）将铜试剂（碱性硫酸铜溶液）中的Cu²⁺还原成Cu⁺，Cu⁺进一步与砷钼酸试剂反应生成蓝色的钼蓝复合物，在500-630 nm（常用520 nm或620 nm）处比色测定。此法灵敏度较高，但操作稍繁琐。

  2. 测色原底物释放的有色基团法：

    • 主要用于测定特定组分酶（如内切葡聚糖酶或β-葡萄糖苷酶）的活力。
    • 底物为人工合成的含染料标记的可溶性纤维素衍生物（如羧甲基纤维素钠CMC-Na，常用于测内切酶活力）或含硝基酚/甲基伞形酮基团的糖苷（如对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷pNPG，用于测β-葡萄糖苷酶活力）。
    • 酶水解底物释放出水溶性有色基团（如染料或硝基酚），通过测定反应液在特定波长（如CMC法测内切酶常用590 nm；pNPG法测β-葡萄糖苷酶常用405 nm）下的吸光度变化来计算酶活力。此法操作简便快速。

  3. 粘度降低法：

    • 主要用于测定内切葡聚糖酶活力。
    • 内切酶随机切断纤维素分子链内部的糖苷键，导致纤维素聚合度下降，溶液粘度急剧降低。
    • 通过测量固定时间内底物溶液（常用CMC溶液）粘度下降的速率（通常使用旋转粘度计或毛细管粘度计）来表征内切酶活力大小。此法反映酶对纤维素聚合度的破坏能力。

  4. 滤纸崩解法：

    • 一种半定量或定性的方法，用于表征纤维素酶复合体系的总体活力。
    • 将滴有定量酶液的滤纸条置于特定缓冲液中，在一定温度和pH下保温。
    • 观察并记录滤纸条完全崩解或断裂所需的时间（崩解时间）。时间越短，酶活力越强。
 

二、 常用标准检测方法：滤纸酶活(FPA)测定 (DNS法)

滤纸酶活（Filter Paper Activity, FPA）是国际上广泛认可的衡量纤维素酶总水解能力（特别是对结晶纤维素）的标准方法，其活性单位定义为：在标准条件下（通常为pH 4.8, 50°C），每分钟由纤维素酶水解滤纸产生1 μmol葡萄糖（或相当于1 μmol还原糖，以葡萄糖计）所需的酶量，称为1个滤纸酶活力单位（Filter Paper Unit, FPU）。

实验步骤：

  1. 试剂配制：

    • 0.05 M 醋酸-醋酸钠缓冲液 (pH 4.8)：称取一定量醋酸钠溶于水中，用冰醋酸调节pH至4.8，定容。
    • DNS试剂：精确配制（通常含DNS酸、氢氧化钠、酒石酸钾钠、苯酚等），避光保存。
    • 葡萄糖标准溶液 (1 mg/mL或2 mg/mL)。
    • 底物：定量剪碎的Whatman No. 1 滤纸（或其他标准定量滤纸）。

  2. 标准曲线制作：

    • 用缓冲液将葡萄糖标准溶液稀释成一系列不同浓度（如20, 40, 60, 80, 100 μg/mL）。
    • 取1.0 mL各浓度葡萄糖标准液于试管中，加入1.0 mL DNS试剂，混匀。
    • 沸水浴中保温5分钟（准确计时），迅速冷却至室温。
    • 加入一定量水（如8 mL或9 mL）混匀。
    • 以不含葡萄糖的空白管（1 mL缓冲液 + 1 mL DNS，同样处理）调零，在540 nm波长下测定各管吸光度(A)。
    • 绘制吸光度(A)对葡萄糖浓度(μg/mL或μmol)的标准曲线。

  3. 酶活力测定：

    • 预试验： 初步估计酶液的活力范围（FPU/mL），用于确定正式测定时合适的酶稀释度（通常要求反应后产物吸光度在标准曲线线性范围内）。
    • 正式测定：
      • 准备试管，加入1.0 mL 0.05 M醋酸缓冲液(pH 4.8)。
      • 加入50 mg (±1 mg) 剪碎的定量滤纸条（确保完全浸入缓冲液）。
      • 加入适当稀释后的酶液0.5 mL（稀释度应使反应产物吸光度落在标准曲线中部）。设空白对照管（用煮沸灭活的酶液或缓冲液代替酶液）。
      • 迅速混匀，立即放入50°C (±0.1°C)恒温水浴中，准确计时保温60分钟。
      • 保温结束，立即从水浴中取出，加入1.0 mL DNS试剂终止反应并开始显色（加入DNS后摇匀）。
      • 所有试管（包括空白）一同放入沸水浴中准确加热5分钟。
      • 取出后迅速冷却至室温。
      • 加入一定量水（如加水至总体积10 mL或11 mL），充分混匀。
      • 空白管调零，在540 nm波长下测定各管吸光度(A)。
    • 计算： 从标准曲线上查出测定管吸光度对应的葡萄糖浓度C (μg/mL)。
      • 产生的葡萄糖量(mg) = C (μg/mL) * [反应总体积(mL) / 1000] (mg/μg转换) * (测定时稀释后的总体积 / 用于测糖的体积)。简化计算时，若最终测糖体积为10mL（含1mL反应液），则葡萄糖量(μg) ≈ C (μg/mL) * 10 mL * (1 mL反应液体积 / 1 mL取样体积) = C * 10。
      • 酶活力(FPU/mL酶原液) = [产生的葡萄糖量(μg) / 180.16 (葡萄糖分子量)] * [1 / 反应时间(min)] * [1 / 加入的酶液体积(mL)] * [稀释倍数] * 10⁶
      • 其中：产生的葡萄糖量单位为μg；除以180.16得μmol数；除以反应时间60min得每分钟产生的μmol数（μmol/min）；除以加入的酶液体积0.5 mL得每毫升稀释酶液的活力（μmol/min/mL）；再乘以稀释倍数得每毫升原酶液的活力（μmol/min/mL）；最后乘以10⁶将单位统一为FPU/mL（1 FPU = 1 μmol葡萄糖/min）。
 

(FPU/mL) = [ (A_sample - A_blank)对应葡萄糖量(μg) * 10 * 稀释倍数 ] / [180.16 * 10⁻³ * 60 * 0.5]

  • (A_sample - A_blank)对应葡萄糖量(μg)：根据标准曲线查得；
  • * 10：因为最终测糖体积通常为10mL（反应混合物1mL + DNS 1mL + 水8mL），1mL反应液被稀释了10倍；
  • 稀释倍数：指测定时所用酶液相对于原酶液的稀释倍数；
  • / 180.16 * 10⁻³：将μg葡萄糖转换为μmol葡萄糖（180.16 μg/μmol）；
  • / 60：反应时间60分钟，转换为每分钟；
  • / 0.5：加入的酶液体积为0.5 mL。
 

三、 羧甲基纤维素酶活(CMCase)测定 (DNS法)

此法主要用于测定内切葡聚糖酶活力（以CMCase活力表示）。单位定义为：在标准条件下（pH 4.8, 50°C），每分钟水解CMC产生1 μmol还原糖（以葡萄糖计）所需的酶量，为1个活力单位（U/mL或IU/mL）。

步骤简述:

  1. 底物：1.0% (w/v) 羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶于醋酸缓冲液(pH 4.8)。
  2. 取1.0 mL底物溶液于试管中，预热至50°C。
  3. 加入0.5 mL适当稀释的酶液，混匀，50°C准确反应30分钟。
  4. 加入1.0 mL DNS试剂终止反应并显色。
  5. 沸水浴5分钟，冷却，加水定容（如至10mL）。
  6. 空白对照（加灭活酶或缓冲液）同样处理，540nm测定吸光度。
  7. 对照标准曲线计算酶活力。计算类似FPA，注意反应时间和底物体积差异。
 

四、 β-葡萄糖苷酶活力测定 (pNPG法)

单位定义为：在标准条件下（pH 4.8, 50°C），每分钟水解pNPG释放出1 μmol对硝基苯酚(pNP)所需的酶量，为1个活力单位（U/mL）。

步骤简述:

  1. 底物：1-5 mM 对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)溶于醋酸缓冲液(pH 4.8)。
  2. 取0.5 mL底物溶液于试管中，预热至50°C。
  3. 加入0.5 mL适当稀释的酶液，混匀，50°C准确反应10-30分钟（依活力高低调整）。
  4. 加入1.0 mL 1 M Na₂CO₃溶液终止反应并显色（碱性条件下pNP呈黄色）。
  5. 空白对照（加入终止剂后再加酶液）。
  6. 立即摇匀，室温放置稳定几分钟。
  7. 405 nm波长下测定吸光度。
  8. 对照对硝基苯酚(pNP)标准曲线计算酶活力。计算原理同上。
 

五、 注意事项

  1. 底物标准化： 滤纸/CMC的规格、来源、处理方式（如剪碎程度）、浓度必须严格控制一致。
  2. 温度与pH控制： 酶促反应对温度pH敏感，水浴温度需精确稳定±0.1°C，缓冲液pH需校准。
  3. 酶液稀释度： 必须确保反应在初速度阶段进行（即产物生成量与酶浓度、时间呈线性关系）。过高浓度的酶会导致底物过早耗尽或产物抑制。
  4. 反应时间： 严格按照规定时间操作。
  5. DNS显色： 沸水浴时间必须准确（5 min），冷却后方可稀释测定。显色后会缓慢褪色，测定应尽快完成。
  6. 平行实验： 每个样品应至少设置3个平行，取平均值。
  7. 空白对照： 必须设置正确的空白对照以扣除背景。
  8. 标准曲线： 每次测定必须伴随制作新鲜的标准曲线。
  9. 酶液保存： 酶液稀释后应尽快使用，避免反复冻融失活。
 

六、 活性检测的意义与应用

准确测定纤维素酶活性对于以下方面至关重要：

  1. 酶制剂质量控制： 评价商品酶制剂的质量和批次稳定性。
  2. 酶学性质研究： 研究酶的pH/温度最适范围、热稳定性、动力学参数(Km, Vmax)、抑制剂/激活剂效应等。
  3. 产酶菌种选育与发酵优化： 筛选高产纤维素酶菌株，优化发酵工艺参数（碳氮源、温度、pH、溶氧、诱导物等）。
  4. 酶解工艺优化： 在生物质转化（如生产燃料乙醇）、纺织、饲料、食品、造纸等应用中，优化酶解条件（酶用量、底物浓度、温度、pH、时间）以获得最佳效率。
  5. 协同效应评估： 研究不同纤维素酶组分（内切酶、外切酶、β-葡萄糖苷酶）之间的协同作用效率。
 

结论

纤维素酶活性检测是其研究和应用的基础。DNS法测定滤纸酶活(FPA)是目前衡量纤维素酶总水解能力的金标准方法。根据研究目标的不同（总活力、内切酶活力、β-葡萄糖苷酶活力），需选择相应的底物和检测方法（如CMC法、pNPG法）。严格遵循标准操作规程，注意控制反应条件、酶浓度、反应时间以及设置正确对照，是获得准确可靠酶活力数据的关键。这些数据对于推动纤维素酶的基础研究和产业化应用具有不可替代的作用。