线粒体异柠檬酸脱氢酶(ICDHm)活性检测

发布时间:2025-06-28 08:01:39 阅读量:1 作者:生物检测中心

线粒体异柠檬酸脱氢酶(ICDHm)活性检测方案

一、 背景与原理

线粒体异柠檬酸脱氢酶(ICDHm, EC 1.1.1.42)是三羧酸循环(TCA循环)中的关键酶之一。它催化异柠檬酸氧化脱羧生成α-酮戊二酸(α-KG),同时将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP⁺)还原为NADPH。检测ICDHm活性对于研究细胞能量代谢、氧化还原平衡、线粒体功能以及相关疾病(如癌症、神经退行性疾病)的机制至关重要。

本方案采用基于NADPH生成的紫外分光光度法。其原理是:在特定反应体系中,ICDHm催化底物异柠檬酸脱氢脱羧,伴随生成的NADPH在340 nm波长处具有特征性吸收峰。通过监测反应体系在340 nm处吸光度随时间的变化速率(ΔA₃₄₀/min),即可计算出ICDHm的催化活性。

二、 试剂与材料

  • 提取缓冲液 (EB):
    • Tris-HCl (缓冲液,pH 7.4, 50 mM)
    • 蔗糖 (0.25 M)
    • EDTA (1 mM)
    • DTT (二硫苏糖醇, 1 mM,新鲜添加)
    • PMSF (苯甲基磺酰氟, 0.1 mM, 或其它蛋白酶抑制剂混合物)
    • 使用前预冷至4°C。
  • 反应缓冲液 (RB):
    • Tris-HCl (缓冲液, pH 7.4, 50 mM)
    • MnCl₂ (金属离子辅因子, 1 mM)
    • NADP⁺ (辅酶, 2 mM)
  • 底物溶液 (SS):
    • DL-异柠檬酸 (三钠盐, 底物, 20 mM, 溶于去离子水中)
  • 阳性对照: 已知ICDHm活性的线粒体样品。
  • 阴性对照: 不含异柠檬酸或不含组织/细胞裂解物的反应体系。
  • 样本: 组织匀浆或细胞裂解物(需预先分离纯化线粒体组分)。
  • 其他:
    • 去离子水
    • 离心管 (微量离心管, 15 mL, 50 mL)
    • 移液器及无菌枪头
    • 冰盒
    • 高速离心机(带有低温转子)
    • 超声破碎仪或玻璃匀浆器(用于线粒体提取)
    • 紫外分光光度计(带恒温比色池)
    • 比色皿(石英或塑料紫外比色皿)
    • 计时器
 

三、 实验步骤

重要提示: 所有操作尽可能在冰上或4°C进行,以最大限度保护酶活性。

  1. 样品制备:

    • 组织样品: 取适量新鲜或液氮速冻的组织,用预冷的EB缓冲液清洗,剪碎。加入适量EB缓冲液(如1:5-10 w/v),在冰上使用匀浆器充分匀浆。将匀浆液在4°C, 1000 g离心10分钟去除细胞碎片和细胞核。取上清液,在4°C, 10, 000-12, 000 g离心15-30分钟。弃上清,沉淀即为粗线粒体组分。用少量预冷的EB缓冲液轻柔重悬沉淀(线粒体悬液),置于冰上待测。蛋白浓度测定(Bradford或BCA法)后,用EB缓冲液调整至所需浓度(通常1-5 mg/mL)。
    • 细胞样品: 收集细胞并用预冷PBS清洗。加入适量预冷的EB缓冲液(含蛋白酶抑制剂)。在冰上使用超声破碎仪(低功率,短时多次)或反复吹打使细胞裂解。后续离心步骤同组织样品。
  2. 反应体系建立 (室温下操作): 在一个干净的比色皿中加入以下组分:

    • 反应缓冲液 (RB): 790 μL
    • 底物溶液 (SS): 100 μL
    • 样本线粒体悬液: 20-100 μL (根据预实验结果调整体积,使ΔA₃₄₀/min在0.01-0.1之间为宜;使用EB缓冲液补足体积差异至总体积1 mL)
  3. 背景测定:

    • 将比色皿放入已预热至37°C的分光光度计样品池支架中。
    • 盖上盖子,平衡1-2分钟。记录340 nm波长处的初始吸光度(A<sub>初始</sub>)。
  4. 酶促反应启动与速率测定:

    • 立即启动计时器并开始连续记录340 nm处的吸光度值(A₃₄₀)。
    • 记录时间窗口通常为1-5分钟,每隔15-30秒记录一次吸光度值。确保反应处于线性期(吸光度随时间呈稳定上升趋势)。
  5. 对照实验:

    • 阳性对照: 使用已知活性的线粒体样品按步骤2-4操作。
    • 阴性对照1 (无底物): 用等体积的去离子水代替底物溶液 (SS)。
    • 阴性对照2 (无样本): 用等体积的EB缓冲液代替样本线粒体悬液。
 

四、 数据分析

  1. 计算吸光度变化速率 (ΔA₃₄₀/min):

    • 绘制吸光度 (A₃₄₀) 对时间 (分钟 min) 的曲线图。
    • 在反应的线性上升阶段(通常是起始的1-3分钟内),选取一段斜率稳定的时间段。
    • 计算该时间段内每分钟吸光度的变化值:
      ΔA₃₄₀/min = (A<sub>终点</sub> - A<sub>初始</sub>) / (t<sub>终点</sub> - t<sub>初始</sub>)
    • 扣除背景: 从样本测得的ΔA₃₄₀/min中减去“无样本”阴性对照的ΔA₃₄₀/min(通常是极小的本底值)。
  2. 计算酶活性:

    • 酶活性单位定义:在特定反应条件下(通常37°C, pH 7.4),每分钟催化生成1 μmol NADPH所需的酶量定义为1个酶活性单位(U)。
    • 计算公式:
      ICDHm活性 (U/mL) = (ΔA₃₄₀/min * V<sub>总</sub> * DF) / (ε * L * V<sub>样</sub>)
      ICDHm活性 (U/mg蛋白) = [ICDHm活性 (U/mL) ] / [蛋白浓度 (mg/mL)]
      • ΔA₃₄₀/min: 扣除背景后的吸光度变化速率 (min⁻¹)
      • V<sub>总</sub>: 反应体系总体积 (mL,通常为1 mL)
      • DF: 样品稀释倍数(指样品加入到反应体系前的稀释倍数)
      • ε: NADPH在340 nm处的摩尔消光系数 (6.22 mM⁻¹ cm⁻¹)
      • L: 比色皿光径 (cm,通常为1 cm)
      • V<sub>样</sub>: 加入到反应体系中的样本体积 (mL)
 

五、 关键注意事项

  1. 低温操作: 样本制备、储存及稀释全程保持低温(冰上或4°C),防止酶失活。
  2. 样本新鲜度: 尽可能使用新鲜样本。冻存样本应分装后储存于-80°C,避免反复冻融。
  3. 线粒体纯度: 检测目标为线粒体异构酶ICDHm,确保样本为分离纯化的线粒体组分至关重要。粗线粒体制备物中可能含有胞浆酶(ICDHc),但其活性较低且最适pH不同(通常胞浆型为NADP⁺依赖,但最适pH接近中性稍偏碱)。严格控制提取条件有助于区分。
  4. 反应线性期: 确保在酶促反应的线性阶段(反应速率恒定)测定ΔA₃₄₀/min。反应时间过长或样本浓度过高可能导致底物消耗或产物抑制,使曲线偏离线性。
  5. 温度控制: 反应体系的温度必须严格控制(通常37°C)。确保分光光度计的比色池温度准确且稳定。
  6. 试剂质量: 使用高纯度试剂(特别是NADP⁺、异柠檬酸),避免杂质干扰。
  7. 重复实验: 每个样本建议进行至少三次独立重复测定以保证结果的可靠性。
  8. 阴性对照: 务必设置“无底物”和“无样本”阴性对照,以排除非特异性反应或背景干扰。
  9. 样品浓度优化: 样本蛋白浓度过高可能导致反应过快超出线性范围或消耗过量底物;过低则信号太弱误差大。需预先进行浓度梯度实验优化。
  10. 金属离子: ICDHm依赖于二价阳离子(Mn²⁺或Mg²⁺),本方案使用MnCl₂。确保其浓度合适且未发生沉淀。
 

六、 应用与意义

该检测方案广泛用于:

  • 基础研究: 评估细胞或组织中线粒体能量代谢状态,研究氧化应激、凋亡、自噬等生理病理过程中ICDHm活性的变化。
  • 疾病机制: 研究与代谢紊乱(如糖尿病、肥胖)、神经退行性疾病(如阿尔茨海默病、帕金森病)、癌症(某些肿瘤中存在IDH基因突变,虽多为胞浆型IDH,但ICDHm活性变化也有报道)等相关的线粒体功能障碍。
  • 药物筛选: 评价药物或化合物对线粒体功能和能量代谢的影响。
  • 遗传病研究: 罕见遗传性线粒体疾病的诊断与研究。
 

七、 疑难解答

  • 信号低或无信号:
    • 样本中ICDHm活性低或酶失活(检查样品制备条件、储存时间和温度)。
    • 底物(异柠檬酸)或辅酶(NADP⁺)失效或浓度不足。
    • 金属离子(Mn²⁺)缺失或失活。
    • 样本加入量太少或蛋白浓度过低。
    • 反应温度过低。
  • 信号过高(超出线性范围):
    • 样本加入量过多或蛋白浓度过高。需稀释样本后重新测定。
  • 反应非线性:
    • 反应时间过长,超出线性期。缩短监测时间。
    • 底物消耗殆尽或产物抑制。降低样品浓度或在更大反应体积中测定。
    • 酶不稳定或失活过快。优化样品处理条件,尽快完成检测。
  • 阴性对照背景高:
    • 试剂(特别是NADP⁺)可能含有微量杂质或发生降解。更换新批次试剂。
    • 比色皿不洁净。彻底清洗比色皿。
 

本方案提供了一种灵敏、可靠且相对简便的线粒体异柠檬酸脱氢酶(ICDHm)活性检测方法,严格遵守操作规范对于获得准确结果至关重要。研究人员可根据具体实验条件和样本类型对方案进行适当优化。