亚硝酸还原酶(NiR)活性检测

发布时间：2025-06-28 08:01:39 阅读量：1 作者：生物检测中心

亚硝酸还原酶(NiR)活性检测方法详解

一、 引言
亚硝酸还原酶(Nitrite reductase, NiR, EC 1.7.7.1/1.6.6.4)是生物体内氮代谢的关键酶之一，广泛存在于植物、藻类、真菌和细菌中。其主要功能是将亚硝酸盐(NO₂⁻)还原为一氧化氮(NO)，这是同化硝酸盐为铵态氮(植物/微生物)或反硝化过程中的关键步骤(微生物)。准确测定NiR活性对于研究氮代谢调控、植物营养效率、环境污染修复及微生物生理功能等具有重要意义。本方法详细描述基于分光光度法的NiR活性检测流程。

二、 检测原理
本方法基于格里斯反应(Griess Reaction)：

  1. 酶促反应： NiR催化亚硝酸盐(NO₂⁻)还原为NO，消耗电子供体(如甲基紫精MV⁺，由连二亚硫酸钠Na₂S₂O₄还原维持)。

    NO₂⁻ + 6MV⁺ (还原态) + 8H⁺ → NO + 6MV²⁺ (氧化态) + 3H₂O

  2. 终止与显色： 在特定时间点，利用锌粉浆终止反应，并促进NO₂⁻完全转化为NO。剩余的NO₂⁻(未被NiR还原部分)与对氨基苯磺酰胺(Sulfanilamide)在酸性环境下反应生成重氮盐。
  3. 偶联显色： 重氮盐进一步与N-(1-萘基)乙二胺盐酸盐(N-(1-Naphthyl)ethylenediamine dihydrochloride, NED)偶联，形成稳定的、在540 nm处有强吸收的粉红色偶氮染料。
  4. 定量分析： 通过测定540 nm处的吸光度值，对照已知浓度的亚硝酸钠标准曲线，即可计算出反应体系中剩余的NO₂⁻量。NiR活性通过单位时间内消耗的NO₂⁻量来表示。
 

三、 试剂与溶液配制
所有试剂均需使用分析纯及以上级别，溶液使用去离子水或超纯水配制。

  1. 提取缓冲液(pH 7.5):
    • 50 mM 磷酸钾缓冲液(KH₂PO₄/K₂HPO₄)
    • 1 mM EDTA (乙二胺四乙酸二钠盐)
    • 10 mM β-巯基乙醇(或1-5 mM DTT, 二硫苏糖醇) （临用前加入）
    • 1% (w/v) 聚乙烯吡咯烷酮(PVP, K30) （用于含酚类物质多的植物样品）
    • 0.1% (v/v) Triton X-100 （可选，用于提高膜结合酶提取效率）
  2. 反应缓冲液(pH 7.5):
    • 50 mM 磷酸钾缓冲液(KH₂PO₄/K₂HPO₄)
    • 1 mM EDTA
  3. 甲基紫精(MV⁺)溶液(25 mM): 溶解适量甲基紫精于水中，棕色瓶4℃避光保存。
  4. 连二亚硫酸钠(Na₂S₂O₄)溶液(100 mM): 称取Na₂S₂O₄溶于预冷(冰浴)的0.3 M NaHCO₃溶液中。临用前配制！ (易氧化)
  5. 亚硝酸钠标准贮备液(10 mM): 准确称取干燥的NaNO₂(69.0 mg)，用水溶解并定容至100 mL。4℃避光保存，有效期约1个月。
  6. 亚硝酸钠标准工作液(0-100 µM): 用反应缓冲液稀释标准贮备液，配制一系列浓度(如0, 10, 20, 30, 50, 70, 100 µM)。
  7. 终止/显色试剂：
    • 溶液A (磺胺溶液): 1% (w/v) 对氨基苯磺酰胺(Sulfanilamide)溶于3 M HCl溶液。
    • 溶液B (偶联剂溶液): 0.02% (w/v) N-(1-萘基)乙二胺盐酸盐(NED)水溶液。棕色瓶4℃避光保存。
    • (可选替代方案: 使用市售预混Griess试剂)
  8. 锌粉浆: 5% (w/v) 锌粉悬浮于水中（充分摇匀后使用）。
  9. 酶稀释液: 与提取缓冲液成分相同(不含PVP和Triton X-100)。
 

四、 仪器设备

  1. 分光光度计(带恒温比色皿架)
  2. 低温高速离心机
  3. 恒温水浴锅或恒温培养箱
  4. 移液器(不同量程)及配套无菌吸头
  5. 研钵/匀浆器(预冷)
  6. 计时器
  7. 漩涡混合器
  8. 冰盒
  9. 比色皿(玻璃或石英，光程1 cm)
  10. 离心管(1.5 mL, 2 mL, 15 mL，预冷)
  11. 冰箱(4℃, -20℃)
  12. pH计
 

五、 实验步骤

A. 样品制备 (全程冰上操作)

  1. 取样: 快速采集目标组织(如植物叶片、根尖、微生物细胞)。植物材料液氮速冻后保存于-80℃或立即使用；微生物可收集对数生长期细胞。
  2. 研磨/破碎:
    • 植物/藻类: 称取适量材料(如0.1-0.5 g鲜重)于预冷研钵中，加入适量(通常3-5倍体积)预冷的提取缓冲液和少量石英砂，冰浴上充分研磨成匀浆。
    • 微生物(细胞): 离心收集细胞，用预冷的提取缓冲液洗涤1-2次。重悬于适量提取缓冲液中。可采用超声破碎(冰浴，间歇式，适当功率和工作时间)或冻融循环辅助裂解。
  3. 离心: 将匀浆液或细胞裂解液转移至预冷离心管中，于4℃下，10000-15000 g离心15-20分钟。
  4. 收集上清: 小心吸取上清液至新预冷离心管中。此上清即为粗酶液。立即置于冰上备用或分装冻存于-80℃(活性可能略有损失，建议尽快测定)。
 

B. 活性测定 (反应在30℃进行)

  1. 准备工作:
    • 将反应缓冲液、甲基紫精溶液、亚硝酸钠标准工作液预热至30℃。
    • 预温分光光度计比色槽至30℃。
    • 准备好终止/显色试剂、锌粉浆和冰盒。
  2. 建立标准曲线 (用于计算剩余NO₂⁻浓度):
    • 取一系列洁净试管或1.5 mL离心管。
    • 分别加入100 µL各浓度的亚硝酸钠标准工作液(0-100 µM)。
    • 向每管中加入：
      • 600 µL 溶液A (磺胺溶液)
      • 100 µL 锌粉浆 (剧烈振荡混匀10-15秒)
      • 300 µL 溶液B (NED溶液)
    • 剧烈振荡混匀，室温下避光静置30分钟。
    • 将混合液转移至比色皿中，在540 nm波长下测定吸光度值(A₅₄₀)。
    • 以NO₂⁻浓度为横坐标(x, µM)，对应的A₅₄₀为纵坐标(y)，绘制标准曲线，获得线性回归方程(y = a + bx)。
  3. 酶促反应与测定:
    • 反应体系(总反应体积通常为1 mL):
      • 反应缓冲液 补充至最终990 µL
      • 100 µL 25 mM 甲基紫精溶液 (终浓度2.5 mM)
      • 10 µL ≈100 mM 连二亚硫酸钠溶液 (必须在加入酶液前立即加入！终浓度≈1 mM，提供电子) (注意: 实际体积需根据Na₂S₂O₄浓度精确计算)
      • 适量酶液 (用量需预实验确定，使反应在5-10分钟内消耗约50%底物) (用酶稀释液调整体积，如50 µL)
    • 操作流程:
      1. 在预热的比色皿或反应管中，依次加入反应缓冲液、甲基紫精溶液。
      2. 加入 新鲜配制 的连二亚硫酸钠溶液，立即混匀。
      3. 迅速加入酶液，立即启动计时器，并充分混匀(此为反应起始时间T₀)。
      4. 将反应混合液置于30℃水浴或恒温比色槽中精确孵育预定时间(如5-10分钟，T₁)。
      5. 到达预定时间时，立即取出反应管/比色皿，加入：
        • 600 µL 溶液A (磺胺溶液)
        • 100 µL 锌粉浆
      6. 立即剧烈振荡混匀10-15秒 (终止酶反应并将残余NO₂⁻转化为NO)。
      7. 加入 300 µL 溶液B (NED溶液)。
      8. 再次剧烈振荡混匀。
      9. 室温下避光静置30分钟，使显色反应完全。
      10. 将混合液转移至比色皿中(如有沉淀可短暂离心取上清)，在540 nm波长下测定吸光度值(A₅₄₀)。
    • 对照设置 (至关重要):
      • 酶空白对照 (无底物对照)： 用等体积酶稀释液代替酶液加入反应体系（不含NaNO₂）。用于扣除酶液中可能存在的内源性物质干扰。
      • 样品空白对照 (无酶对照)： 用等体积酶稀释液代替酶液加入反应体系（含NaNO₂）。用于扣除非酶促反应消耗的NO₂⁻。
      • 标准曲线管 (见B.2步骤)。
 

C. 计算

  1. 计算剩余NO₂⁻浓度 (C_R, µM):
    • 根据样品的A₅₄₀值(需减去对应的酶空白对照的A₅₄₀值)，代入标准曲线的线性回归方程(y = a + bx)，计算得出反应终止时体系中剩余的NO₂⁻浓度(C_R)。
  2. 计算消耗的NO₂⁻量 (ΔC, µM):
    • ΔC = C₀ - C_R
    • C₀ 是反应开始时加入的NO₂⁻浓度（通常为50 µM或100 µM，根据加入的体积和浓度计算实际终浓度）。
    • (注意：需减去样品空白对照消耗的NO₂⁻量 ΔC_blank) → 实际酶促消耗 ΔC_enzyme = ΔC_sample - ΔC_blank
  3. 计算酶活性 (Activity):
    • 单位定义: 通常定义为：在特定条件(如30℃, pH 7.5)下，单位时间(min)内，单位质量蛋白(mg)或单位样品鲜重(g FW)所消耗的NO₂⁻的量(nmol)。
    • 公式:
  
 
 
 
Activity (nmol NO₂⁻ min⁻¹ mg⁻¹ prot 或 g⁻¹ FW) = (ΔC_enzyme * V_t * DF) / (t * V_e * P)
 
 
 
* `ΔC_enzyme`: 酶促反应实际消耗的NO₂⁻浓度 (µM = µmol/L = nmol/mL) * `V_t`: 酶促反应终止时的总体积 **(单位: mL)** (包括终止/显色试剂体积，通常为1 mL + 600 µL + 100 µL + 300 µL = 2 mL) * `DF`: 显色反应前的稀释倍数 (此步骤通常未稀释，DF=1。若转移上清或稀释则需计算) * `t`: 酶促反应时间 **(单位: min)** * `V_e`: 加入反应体系中的酶液体积 **(单位: mL)** * `P`: 酶液中蛋白浓度 **(单位: mg prot/mL)** **或** 每mL酶液对应的样品鲜重 **(单位: g FW/mL)** (根据单位定义选择) * **简化理解核心：** (消耗的NO₂⁻摩尔数) / (反应时间 * 酶量或样品量) * **换算常数：** 注意ΔC_enzyme单位是µM (即nmol/mL)，V_t单位是mL，相乘后单位是nmol。除以t(min)、V_e(mL)、P(mg prot/mL 或 g FW/mL)，即得到最终单位 nmol min⁻¹ mg⁻¹ prot 或 nmol min⁻¹ g⁻¹ FW。

六、 注意事项与质量控制

  1. 关键试剂新鲜度： Na₂S₂O₄必须新鲜配制，操作迅速。甲基紫精溶液避免反复冻融和光照。NED溶液避光保存，若颜色变深则弃用。
  2. 温度控制： 酶提取和反应温度需精确控制。全程冰浴操作提取，反应精确控温(30℃)。
  3. 时间精确性： 酶促反应起始和终止计时必须精确一致。
  4. 混匀充分： 加入连二亚硫酸钠后需立即混匀启动反应；加入终止试剂后需剧烈振荡确保反应终止和NO₂⁻完全转化。
  5. 酶活性范围： 预实验确定合适的酶液用量和反应时间，使NO₂⁻消耗量在标准曲线线性范围内（一般为起始浓度的20%-80%）。避免反应过快（底物耗尽）或过慢（误差大）。
  6. 对照设置： 必须设置严格的酶空白和样品空白对照，以扣除背景干扰和非酶消耗。
  7. 蛋白浓度测定： 若以比活性表示，需用Bradford法或BCA法精确测定粗酶液的蛋白质浓度。
  8. 样本代表性与重复： 确保样本均一性，每个样品至少设置3个独立的生物学重复和技术重复。
  9. 底物稳定性： NO₂⁻在酸性条件和光下不稳定，标准液注意保存条件和使用。
  10. 安全防护： 操作β-巯基乙醇、盐酸、NED等试剂时需在通风橱进行，佩戴手套、口罩和护目镜。Na₂S₂O₄遇酸产生有毒SO₂，避免与酸接触。废弃液按实验室规定处理。
 

七、 应用与意义
本方法可广泛应用于：

  • 植物生理研究： 评估不同品种、不同氮素营养条件、逆境胁迫(盐、旱、重金属等)下植物叶片、根系的同化硝酸盐能力。
  • 微生物学研究： 测定细菌、真菌中NiR活性，研究反硝化过程、氮循环效率或特定微生物菌株的脱氮性能。
  • 环境科学： 评估土壤、湿地、污水处理系统中微生物群落的硝化-反硝化潜力。
  • 基因功能研究： 验证与NiR相关的基因过表达或敲除后酶活性的变化。
  • 食品与发酵工业： 监控发酵过程中微生物的氮代谢状态。
 

八、 总结
本方法详细描述了基于格里斯反应分光光度法测定亚硝酸还原酶(NiR)活性的完整流程。该方法具有原理清晰、操作相对简便、成本较低、灵敏度较高的优点，是研究生物体硝酸盐同化和反硝化过程中NiR功能的可靠工具。严格遵守实验步骤、精确控制条件、设置必要的对照是获得准确可靠结果的关键。