亚硝酸还原酶(NiR)活性检测方法详解
一、 引言
亚硝酸还原酶(Nitrite reductase, NiR, EC 1.7.7.1/1.6.6.4)是生物体内氮代谢的关键酶之一,广泛存在于植物、藻类、真菌和细菌中。其主要功能是将亚硝酸盐(NO₂⁻)还原为一氧化氮(NO),这是同化硝酸盐为铵态氮(植物/微生物)或反硝化过程中的关键步骤(微生物)。准确测定NiR活性对于研究氮代谢调控、植物营养效率、环境污染修复及微生物生理功能等具有重要意义。本方法详细描述基于分光光度法的NiR活性检测流程。
二、 检测原理
本方法基于格里斯反应(Griess Reaction):
- 酶促反应: NiR催化亚硝酸盐(NO₂⁻)还原为NO,消耗电子供体(如甲基紫精MV⁺,由连二亚硫酸钠Na₂S₂O₄还原维持)。
NO₂⁻ + 6MV⁺ (还原态) + 8H⁺ → NO + 6MV²⁺ (氧化态) + 3H₂O
- 终止与显色: 在特定时间点,利用锌粉浆终止反应,并促进NO₂⁻完全转化为NO。剩余的NO₂⁻(未被NiR还原部分)与对氨基苯磺酰胺(Sulfanilamide)在酸性环境下反应生成重氮盐。
- 偶联显色: 重氮盐进一步与N-(1-萘基)乙二胺盐酸盐(N-(1-Naphthyl)ethylenediamine dihydrochloride, NED)偶联,形成稳定的、在540 nm处有强吸收的粉红色偶氮染料。
- 定量分析: 通过测定540 nm处的吸光度值,对照已知浓度的亚硝酸钠标准曲线,即可计算出反应体系中剩余的NO₂⁻量。NiR活性通过单位时间内消耗的NO₂⁻量来表示。
三、 试剂与溶液配制
所有试剂均需使用分析纯及以上级别,溶液使用去离子水或超纯水配制。
- 提取缓冲液(pH 7.5):
- 50 mM 磷酸钾缓冲液(KH₂PO₄/K₂HPO₄)
- 1 mM EDTA (乙二胺四乙酸二钠盐)
- 10 mM β-巯基乙醇(或1-5 mM DTT, 二硫苏糖醇) (临用前加入)
- 1% (w/v) 聚乙烯吡咯烷酮(PVP, K30) (用于含酚类物质多的植物样品)
- 0.1% (v/v) Triton X-100 (可选,用于提高膜结合酶提取效率)
- 反应缓冲液(pH 7.5):
- 50 mM 磷酸钾缓冲液(KH₂PO₄/K₂HPO₄)
- 1 mM EDTA
- 甲基紫精(MV⁺)溶液(25 mM): 溶解适量甲基紫精于水中,棕色瓶4℃避光保存。
- 连二亚硫酸钠(Na₂S₂O₄)溶液(100 mM): 称取Na₂S₂O₄溶于预冷(冰浴)的0.3 M NaHCO₃溶液中。临用前配制! (易氧化)
- 亚硝酸钠标准贮备液(10 mM): 准确称取干燥的NaNO₂(69.0 mg),用水溶解并定容至100 mL。4℃避光保存,有效期约1个月。
- 亚硝酸钠标准工作液(0-100 µM): 用反应缓冲液稀释标准贮备液,配制一系列浓度(如0, 10, 20, 30, 50, 70, 100 µM)。
- 终止/显色试剂:
- 溶液A (磺胺溶液): 1% (w/v) 对氨基苯磺酰胺(Sulfanilamide)溶于3 M HCl溶液。
- 溶液B (偶联剂溶液): 0.02% (w/v) N-(1-萘基)乙二胺盐酸盐(NED)水溶液。棕色瓶4℃避光保存。
- (可选替代方案: 使用市售预混Griess试剂)
- 锌粉浆: 5% (w/v) 锌粉悬浮于水中(充分摇匀后使用)。
- 酶稀释液: 与提取缓冲液成分相同(不含PVP和Triton X-100)。
四、 仪器设备
- 分光光度计(带恒温比色皿架)
- 低温高速离心机
- 恒温水浴锅或恒温培养箱
- 移液器(不同量程)及配套无菌吸头
- 研钵/匀浆器(预冷)
- 计时器
- 漩涡混合器
- 冰盒
- 比色皿(玻璃或石英,光程1 cm)
- 离心管(1.5 mL, 2 mL, 15 mL,预冷)
- 冰箱(4℃, -20℃)
- pH计
五、 实验步骤
A. 样品制备 (全程冰上操作)
- 取样: 快速采集目标组织(如植物叶片、根尖、微生物细胞)。植物材料液氮速冻后保存于-80℃或立即使用;微生物可收集对数生长期细胞。
- 研磨/破碎:
- 植物/藻类: 称取适量材料(如0.1-0.5 g鲜重)于预冷研钵中,加入适量(通常3-5倍体积)预冷的提取缓冲液和少量石英砂,冰浴上充分研磨成匀浆。
- 微生物(细胞): 离心收集细胞,用预冷的提取缓冲液洗涤1-2次。重悬于适量提取缓冲液中。可采用超声破碎(冰浴,间歇式,适当功率和工作时间)或冻融循环辅助裂解。
- 离心: 将匀浆液或细胞裂解液转移至预冷离心管中,于4℃下,10000-15000 g离心15-20分钟。
- 收集上清: 小心吸取上清液至新预冷离心管中。此上清即为粗酶液。立即置于冰上备用或分装冻存于-80℃(活性可能略有损失,建议尽快测定)。
B. 活性测定 (反应在30℃进行)
- 准备工作:
- 将反应缓冲液、甲基紫精溶液、亚硝酸钠标准工作液预热至30℃。
- 预温分光光度计比色槽至30℃。
- 准备好终止/显色试剂、锌粉浆和冰盒。
- 建立标准曲线 (用于计算剩余NO₂⁻浓度):
- 取一系列洁净试管或1.5 mL离心管。
- 分别加入100 µL各浓度的亚硝酸钠标准工作液(0-100 µM)。
- 向每管中加入:
- 600 µL 溶液A (磺胺溶液)
- 100 µL 锌粉浆 (剧烈振荡混匀10-15秒)
- 300 µL 溶液B (NED溶液)
- 剧烈振荡混匀,室温下避光静置30分钟。
- 将混合液转移至比色皿中,在540 nm波长下测定吸光度值(A₅₄₀)。
- 以NO₂⁻浓度为横坐标(x, µM),对应的A₅₄₀为纵坐标(y),绘制标准曲线,获得线性回归方程(y = a + bx)。
- 酶促反应与测定:
- 反应体系(总反应体积通常为1 mL):
- 反应缓冲液 补充至最终990 µL
- 100 µL 25 mM 甲基紫精溶液 (终浓度2.5 mM)
- 10 µL ≈100 mM 连二亚硫酸钠溶液 (必须在加入酶液前立即加入!终浓度≈1 mM,提供电子) (注意: 实际体积需根据Na₂S₂O₄浓度精确计算)
- 适量酶液 (用量需预实验确定,使反应在5-10分钟内消耗约50%底物) (用酶稀释液调整体积,如50 µL)
- 操作流程:
- 在预热的比色皿或反应管中,依次加入反应缓冲液、甲基紫精溶液。
- 加入 新鲜配制 的连二亚硫酸钠溶液,立即混匀。
- 迅速加入酶液,立即启动计时器,并充分混匀(此为反应起始时间T₀)。
- 将反应混合液置于30℃水浴或恒温比色槽中精确孵育预定时间(如5-10分钟,T₁)。
- 到达预定时间时,立即取出反应管/比色皿,加入:
- 600 µL 溶液A (磺胺溶液)
- 100 µL 锌粉浆
- 立即剧烈振荡混匀10-15秒 (终止酶反应并将残余NO₂⁻转化为NO)。
- 加入 300 µL 溶液B (NED溶液)。
- 再次剧烈振荡混匀。
- 室温下避光静置30分钟,使显色反应完全。
- 将混合液转移至比色皿中(如有沉淀可短暂离心取上清),在540 nm波长下测定吸光度值(A₅₄₀)。
- 对照设置 (至关重要):
- 酶空白对照 (无底物对照): 用等体积酶稀释液代替酶液加入反应体系(不含NaNO₂)。用于扣除酶液中可能存在的内源性物质干扰。
- 样品空白对照 (无酶对照): 用等体积酶稀释液代替酶液加入反应体系(含NaNO₂)。用于扣除非酶促反应消耗的NO₂⁻。
- 标准曲线管 (见B.2步骤)。
- 反应体系(总反应体积通常为1 mL):
C. 计算
- 计算剩余NO₂⁻浓度 (C_R, µM):
- 根据样品的A₅₄₀值(需减去对应的酶空白对照的A₅₄₀值),代入标准曲线的线性回归方程(y = a + bx),计算得出反应终止时体系中剩余的NO₂⁻浓度(C_R)。
- 计算消耗的NO₂⁻量 (ΔC, µM):
- ΔC = C₀ - C_R
C₀
是反应开始时加入的NO₂⁻浓度(通常为50 µM或100 µM,根据加入的体积和浓度计算实际终浓度)。- (注意:需减去样品空白对照消耗的NO₂⁻量 ΔC_blank) → 实际酶促消耗 ΔC_enzyme = ΔC_sample - ΔC_blank
- 计算酶活性 (Activity):
- 单位定义: 通常定义为:在特定条件(如30℃, pH 7.5)下,单位时间(min)内,单位质量蛋白(mg)或单位样品鲜重(g FW)所消耗的NO₂⁻的量(nmol)。
- 公式:
Activity (nmol NO₂⁻ min⁻¹ mg⁻¹ prot 或 g⁻¹ FW) = (ΔC_enzyme * V_t * DF) / (t * V_e * P)
* `ΔC_enzyme`: 酶促反应实际消耗的NO₂⁻浓度 (µM = µmol/L = nmol/mL) * `V_t`: 酶促反应终止时的总体积 **(单位: mL)** (包括终止/显色试剂体积,通常为1 mL + 600 µL + 100 µL + 300 µL = 2 mL) * `DF`: 显色反应前的稀释倍数 (此步骤通常未稀释,DF=1。若转移上清或稀释则需计算) * `t`: 酶促反应时间 **(单位: min)** * `V_e`: 加入反应体系中的酶液体积 **(单位: mL)** * `P`: 酶液中蛋白浓度 **(单位: mg prot/mL)** **或** 每mL酶液对应的样品鲜重 **(单位: g FW/mL)** (根据单位定义选择) * **简化理解核心:** (消耗的NO₂⁻摩尔数) / (反应时间 * 酶量或样品量) * **换算常数:** 注意ΔC_enzyme单位是µM (即nmol/mL),V_t单位是mL,相乘后单位是nmol。除以t(min)、V_e(mL)、P(mg prot/mL 或 g FW/mL),即得到最终单位 nmol min⁻¹ mg⁻¹ prot 或 nmol min⁻¹ g⁻¹ FW。
六、 注意事项与质量控制
- 关键试剂新鲜度: Na₂S₂O₄必须新鲜配制,操作迅速。甲基紫精溶液避免反复冻融和光照。NED溶液避光保存,若颜色变深则弃用。
- 温度控制: 酶提取和反应温度需精确控制。全程冰浴操作提取,反应精确控温(30℃)。
- 时间精确性: 酶促反应起始和终止计时必须精确一致。
- 混匀充分: 加入连二亚硫酸钠后需立即混匀启动反应;加入终止试剂后需剧烈振荡确保反应终止和NO₂⁻完全转化。
- 酶活性范围: 预实验确定合适的酶液用量和反应时间,使NO₂⁻消耗量在标准曲线线性范围内(一般为起始浓度的20%-80%)。避免反应过快(底物耗尽)或过慢(误差大)。
- 对照设置: 必须设置严格的酶空白和样品空白对照,以扣除背景干扰和非酶消耗。
- 蛋白浓度测定: 若以比活性表示,需用Bradford法或BCA法精确测定粗酶液的蛋白质浓度。
- 样本代表性与重复: 确保样本均一性,每个样品至少设置3个独立的生物学重复和技术重复。
- 底物稳定性: NO₂⁻在酸性条件和光下不稳定,标准液注意保存条件和使用。
- 安全防护: 操作β-巯基乙醇、盐酸、NED等试剂时需在通风橱进行,佩戴手套、口罩和护目镜。Na₂S₂O₄遇酸产生有毒SO₂,避免与酸接触。废弃液按实验室规定处理。
七、 应用与意义
本方法可广泛应用于:
- 植物生理研究: 评估不同品种、不同氮素营养条件、逆境胁迫(盐、旱、重金属等)下植物叶片、根系的同化硝酸盐能力。
- 微生物学研究: 测定细菌、真菌中NiR活性,研究反硝化过程、氮循环效率或特定微生物菌株的脱氮性能。
- 环境科学: 评估土壤、湿地、污水处理系统中微生物群落的硝化-反硝化潜力。
- 基因功能研究: 验证与NiR相关的基因过表达或敲除后酶活性的变化。
- 食品与发酵工业: 监控发酵过程中微生物的氮代谢状态。
八、 总结
本方法详细描述了基于格里斯反应分光光度法测定亚硝酸还原酶(NiR)活性的完整流程。该方法具有原理清晰、操作相对简便、成本较低、灵敏度较高的优点,是研究生物体硝酸盐同化和反硝化过程中NiR功能的可靠工具。严格遵守实验步骤、精确控制条件、设置必要的对照是获得准确可靠结果的关键。