谷氨酸脱氢酶(GDH)活性检测

发布时间：2025-06-28 08:01:39 阅读量：1 作者：生物检测中心

谷氨酸脱氢酶(GDH)活性检测：原理、方法与应用

一、 引言

谷氨酸脱氢酶 (Glutamate Dehydrogenase, GDH; EC 1.4.1.3) 是一种广泛存在于生物体内的代谢关键酶。它以辅酶 NAD⁺ 或 NADP⁺ 为辅因子，在催化 L-谷氨酸氧化脱氨生成 α-酮戊二酸和氨的可逆反应中发挥核心作用：
L-谷氨酸 + H₂O + NAD(P)⁺ ⇌ α-酮戊二酸 + NH₄⁺ + NAD(P)H + H⁺

GDH 活性检测在多个领域至关重要：

  • 基础研究： 研究能量代谢、氨代谢、氨基酸代谢途径调控。
  • 临床诊断： 评估肝细胞损伤（尤其是线粒体损伤）、监测某些肝病进程。
  • 食品/微生物工业： 监控发酵过程、评估酶制剂活性。
  • 环境科学： 研究微生物氮循环。
 

二、 检测原理 (紫外分光光度法 - 最常用)

目前最常用、最灵敏且特异的 GDH 活性检测方法是基于 紫外分光光度法 (UV Spectrophotometry)，利用辅酶 NAD(P)H 在特定波长下的吸光特性进行测定。

  • 反应方向： 通常选择检测 谷氨酸氧化脱氨 的方向，因其动力学特性更优。
    L-谷氨酸 + NAD⁺ + H₂O → α-酮戊二酸 + NADH + NH₄⁺ + H⁺

  • 检测原理： 在反应体系中，NAD⁺ 作为辅酶被还原生成 NADH。NADH 在 340 nm 波长处具有特征性吸收峰，其吸光度的增加速率 (ΔA₃₄₀/min) 与单位时间内 NADH 的生成量成正比，而 NADH 的生成量又直接反映 GDH 催化反应的速率。因此，通过连续监测 340 nm 处吸光度随时间的变化，即可计算出 GDH 的酶活性。

  • 关键组分：

    • 底物： L-谷氨酸 (饱和浓度，通常 50-100 mM)
    • 辅酶： NAD⁺ (或 NADP⁺，依同工酶而定，常用浓度 2-5 mM)
    • 激活剂 (可选但常用)： ADP (增强哺乳动物 GDH 活性，常用 1-2 mM)
    • 缓冲液： 维持反应体系 pH 稳定。常用缓冲液包括：
      • Tris-HCl 缓冲液 (pH 7.5 - 8.5，常用于哺乳动物来源)
      • 磷酸钾缓冲液 (pH 7.0 - 8.0)
      • 焦磷酸钠缓冲液 (pH 8.0 - 9.0，有时用于微生物来源) 浓度通常为 50-100 mM。
    • 样本： 含 GDH 的溶液（如血清、组织匀浆上清、细胞裂解液、纯化酶液、微生物粗提液等）。样本需适当稀释，确保反应初速度在线性范围内。
 

三、 检测方法 (紫外分光光度法步骤)

试剂配制 (示例配方，实际浓度需优化)：

  1. 缓冲液 (50 mM Tris-HCl, pH 8.0): 称取适量 Tris 碱，溶于约 80 mL 纯水，用 HCl 调节 pH 至 8.0，定容至 100 mL。
  2. 底物/辅酶/激活剂混合液 (临用前配制)：
    • L-谷氨酸 (终浓度 ~80 mM)
    • NAD⁺ (终浓度 ~2.5 mM)
    • ADP (终浓度 ~1.5 mM) - 若需要
    • 用上述缓冲液溶解并混合均匀。
  3. 样本稀释液： 通常选用配制缓冲液的缓冲体系或其他合适的等渗稀释液。
 

操作步骤 (以1cm光径比色皿为例)：

  1. 预热： 开启紫外/可见分光光度计，设定波长至 340 nm。将比色皿室温度设定并稳定在所需温度（通常 25°C, 30°C 或 37°C）。
  2. 空白对照设置：
    • 向石英比色皿中加入：
      • 1.0 mL 缓冲液
      • 适当体积的纯水 (使总体积达到 1.4 mL)
      • 0.1 mL 样本稀释液 (不含酶活性) 或空白对照样本 (如空白血清、缓冲液)
    • 温和混匀，放入预热的比色皿槽中平衡至少 2 分钟。
    • 读取并记录初始吸光度 (A₀)。
  3. 反应体系设置：
    • 向另一干净石英比色皿中加入：
      • 1.0 mL 预热好的底物/辅酶/激活剂混合液
      • 适当体积的纯水 (使总体积达到 1.4 mL)
    • 温和混匀，放入预热的比色皿槽中平衡至少 2 分钟。
    • 读取并记录初始吸光度作为基线 (A₁)。
  4. 启动反应与监测：
    • 迅速加入 0.1 mL 稀释好的待测样本溶液 (含GDH)。
    • 立即上下轻柔颠倒混匀数次 (避免产生气泡)。
    • 迅速将比色皿放回比色槽。
    • 启动仪器的时间扫描模式，连续监测 340 nm 处吸光度的变化 (ΔA/min) 至少 3-5 分钟 (或更长时间，确保获得稳定的线性变化区间)。
    • 记录吸光度随时间增加的线性斜率 (ΔA/min)。重要提示： 必须确保选择反应速率恒定的线性阶段进行计算。
  5. 样本空白 (可选但推荐)： 设置一个仅缺少底物 L-谷氨酸 (用等体积缓冲液替代) 的反应体系，加入样本后监测 ΔA₃₄₀/min。此值用于扣除样本中可能存在的内源性 NADH 氧化酶等干扰反应导致的背景变化。
 

四、 活性计算

酶活性单位通常定义为：

  • 国际单位 (U)： 在特定条件下 (温度、pH)，每分钟催化转化 1 微摩尔 (μmol) 底物所需的酶量。
  • 对于 GDH (谷氨酸氧化方向)：每分钟催化生成 1 μmol NADH (或消耗 1 μmol L-谷氨酸) 所需的酶量定义为 1 单位 (U)。
 

计算公式 (基于 1 cm 光径)：
GDH 活性 (U/mL 样本或 U/mg 蛋白) = [(ΔA₃₄₀/min)ᵣₑₐcₜᵢₒₙ - (ΔA₃₄₀/min)ₛₐₘₚₗₑ bₗₐₙₖ] × (Vₜᵣₐcₜᵢₒₙ) / (ε × d × Vₛₐₘₚₗₑ) × DF

  • (ΔA₃₄₀/min)ᵣₑₐcₜᵢₒₙ： 反应体系的吸光度每分钟变化值 (来自步骤4)。
  • (ΔA₃₄₀/min)ₛₐₘₚₗₑ bₗₐₙₖ： 样本空白体系的吸光度每分钟变化值 (若有，来自步骤5)。
  • Vₜᵣₐcₜᵢₒₙ： 反应体系的最终总体积 (单位：mL)。示例中为 1.5 mL (1.0 mL 混合液 + 0.4 mL 水 + 0.1 mL 样本)。
  • ε： NADH 在 340 nm 处的摩尔消光系数 (单位：L·mol⁻¹·cm⁻¹)。标准值为 6220 L·mol⁻¹·cm⁻¹ (在 pH 7-8 水溶液中)。 (注意：不同文献/条件下可能有微小差异，使用前需确认)
  • d： 比色皿光径长度 (单位：cm)。通常为 1 cm。
  • Vₛₐₘₚₗₑ： 加入反应体系的样本体积 (单位：mL)。示例中为 0.1 mL。
  • DF： 样本稀释倍数 (若原始样本在检测前被稀释过)。
  • U/mL 样本： 计算结果直接用于液体样本 (如血清)。
  • U/mg 蛋白： 若样本为组织匀浆或细胞裂解液，需额外测定样本中的总蛋白浓度 (如 Bradford 法、BCA 法)，再将活性除以总蛋白浓度 (mg/mL) 得到比活性 (U/mg protein)。
 

五、 关键注意事项

  1. 线性范围验证： 酶反应速率 (ΔA/min) 必须在整个监测时间段内保持线性。需通过预实验确定合适的样本稀释度、监测时间长度及底物浓度是否饱和。
  2. 温度控制： 酶活性对温度敏感，必须精确控制比色皿室的温度 (±0.1°C)。
  3. pH 值准确性： 缓冲液的 pH 值需准确配制并使用校准过的 pH 计测量。pH 值显著影响 GDH 活性。
  4. 样本处理： 样本 (特别是血清、组织) 应尽快分离和处理，避免反复冻融以保持酶活性稳定。组织样本需在冰浴中快速匀浆，离心去除碎片获取上清酶液。
  5. 辅酶特异性： 明确待测 GDH 的辅酶偏好性 (NAD⁺、NADP⁺ 或两者皆可)，选择合适的辅酶。
  6. 激活剂/抑制剂： 了解待测来源 GDH 的调节特性 (如哺乳动物 GDH 通常受 ADP 激活，受 GTP、ATP 抑制)，在反应体系中根据需要添加激活剂或避免抑制剂存在。
  7. 干扰物质： 血清中高浓度的胆红素、脂质可能干扰吸光度读数，需考虑样本空白或进行适当处理。样本中存在的其他酶 (如乳酸脱氢酶 LDH) 也可能消耗 NADH 产生干扰，样本空白有助于校正。
  8. 仪器校准： 定期校准分光光度计的波长和吸光度准确性。
  9. 试剂质量： 使用高纯度的底物 (L-谷氨酸)、辅酶 (NAD⁺)、缓冲盐和水 (推荐≥18.2 MΩ·cm 的去离子水)。
 

六、 替代方法：比色法

虽然紫外分光光度法是金标准，但在特定情况下 (如无紫外分光光度计)，也可采用基于产物氨 (NH₄⁺) 检测的 比色法。

  • 原理： 通过 Berthelot 反应或其他氨检测试剂 (如靛酚蓝法)，使反应生成的 NH₄⁺ 与试剂显色，在可见光区 (通常 630-640 nm) 测定吸光度增加。
  • 步骤： 设定反应体系 (含谷氨酸、辅酶、缓冲液、激活剂、样本)，在恒温孵育一定时间 (确保在线性反应期内) 后，加入强碱溶液 (如 NaOH/KOH) 终止反应。然后加入显色剂，孵育显色后测定吸光度。同时设置不含底物或终止后加入底物的空白对照。
  • 计算： 根据标准曲线 (用已知浓度的 NH₄⁺ 标准品制作) 计算单位时间内生成的 NH₄⁺ 量，进而计算活性。
  • 优缺点：
    • 优点： 可在可见光分光光度计上操作，成本可能较低。
    • 缺点： 灵敏度通常低于紫外法 (受显色反应限制)，操作步骤更繁琐 (需终止反应和显色)，显色反应条件 (温度、时间、pH) 控制要求严，可能存在更多干扰物质，通常为终点法而非连续监测法。
 

七、 结果解读与应用

  • 基础研究： GDH 活性高低反映细胞或生物体在特定条件下谷氨酸代谢、氨同化/脱氨、能量 (通过 α-酮戊二酸进入 TCA 循环) 代谢的活跃程度。
  • 临床诊断 (血清 GDH)：
    • 肝细胞损伤标志物： GDH 主要位于肝细胞线粒体内。血清 GDH 活性显著升高 强烈提示肝细胞损伤，尤其是有明显线粒体损伤的情况 (如急性肝炎、药物或毒素性肝损伤、缺血性肝炎、严重酒精性肝炎、肝癌)。
    • 特异性： 相较于 ALT、AST 等胞浆酶，血清 GDH 升高对 严重的、累及线粒体的肝细胞坏死 更具特异性。由于其在血液中清除较快，持续升高可能提示存在持续的肝细胞损伤。
    • 与 ALT/AST 比值： 高 GDH/ALT 比值可能提示更严重的肝细胞损伤模式 (如大片坏死)。
    • 局限性： 骨骼肌、心肌、肾、脑等组织中也存在少量 GDH，严重损伤时也可能释放入血；肝损伤时升高程度不一定与 ALT/AST 平行 (取决于损伤模式)；灵敏度可能不如 ALT/AST，特别是在轻度肝损伤时。
  • 其他应用： 在微生物发酵中监控 GDH 活性有助于了解氮源利用效率和菌体代谢状态。在酶制剂生产中，活性测定是质量控制的核心指标。
 

八、 结论

谷氨酸脱氢酶 (GDH) 活性检测是研究氨基酸代谢、能量代谢以及评估肝细胞线粒体损伤的重要工具。紫外分光光度法基于 NAD(P)H 在 340 nm 吸光度变化的原理，因其灵敏度高、特异性好、操作相对简便并能实时监测反应动力学，成为实验室检测 GDH 活性的首选方法。严格把控样本处理、试剂配制、反应条件 (温度、pH、线性范围) 和计算参数 (如消光系数) 是获得可靠结果的关键。正确解读 GDH 活性数据，特别是在临床血清学检测中，需结合其他肝功能指标和患者的临床表现进行综合分析。