谷氨酸合成酶(GOGAT)活性检测

发布时间：2025-06-28 08:01:39 阅读量：2 作者：生物检测中心

谷氨酸合成酶(GOGAT)活性检测方法

一、引言

谷氨酸合成酶(Glutamate synthase, GOGAT, EC 1.4.1.13/14)是生物体氮同化代谢途径中的关键酶，在谷氨酰胺转化为谷氨酸的过程中扮演核心角色。该酶广泛存在于植物、微生物中，负责将谷氨酰胺的酰胺基转移至α-酮戊二酸(α-KG)，最终生成两分子谷氨酸。GOGAT活性的高低直接影响生物体对氮源的利用效率和氨基酸合成能力，是研究氮代谢调控、植物生长发育、微生物固氮及环境适应性的重要指标。准确测定其活性对于深入理解相关生理生化过程至关重要。

二、检测原理

本方法基于谷氨酸脱氢酶(GDH)偶联法，通过检测还原型辅酶I(NADH)的氧化速率间接反映GOGAT活性。其反应过程如下：

  1. GOGAT催化反应：
    谷氨酰胺 (Gln) + α-酮戊二酸 (α-KG) + NADH + H⁺ → 2 谷氨酸 (Glu) + NAD⁺

  2. 偶联反应 (GDH催化)：
    α-酮戊二酸 (α-KG) + NADH + NH₄⁺ → 谷氨酸 (Glu) + NAD⁺ + H₂O
    (注：此步仅在反应体系中存在铵离子(NH₄⁺)时发生，用于消耗未被GOGAT利用的α-KG，防止背景干扰。部分方法使用此偶联反应消耗残留底物)

  3. 信号检测：
    GOGAT催化反应本身消耗NADH，导致其在340 nm处的吸光度下降。通过连续监测反应体系在340 nm波长处吸光度(OD₃₄₀)随时间的降低速率，即可计算出NADH的消耗速率，该速率与GOGAT的活性成正比。

 

三、实验材料与试剂

  • 样品： 待测组织（如植物叶片、根、种子；微生物细胞）的粗酶提取液。提取方法通常包括：液氮研磨，用预冷的提取缓冲液（如50-100 mM Tris-HCl或磷酸钾缓冲液，pH 7.5-8.0，含适量EDTA或EGTA螯合金属离子，5-15%甘油稳定酶，1-5 mM DTT或β-巯基乙醇保护巯基，可能含PVP或PEG去除酚类物质）匀浆，高速离心（如12,000-15,000 g，15-30 min，4℃），取上清液作为酶液。蛋白浓度需测定（如Bradford法）。
  • 主要试剂 (均使用分析纯试剂)：
    • Tris-HCl缓冲液 (100 mM, pH 7.8) 或磷酸钾缓冲液 (50-100 mM, pH 7.5)
    • L-谷氨酰胺 (L-Glutamine, Gln) 溶液 (50-100 mM)
    • α-酮戊二酸 (α-Ketoglutarate, α-KG) 溶液 (10-20 mM)
    • 还原型辅酶I二钠盐 (β-NADH) 溶液 (2-3 mM, 临用前配制于缓冲液或水中)
    • 谷氨酸脱氢酶 (Glutamate dehydrogenase, GDH) 溶液 (适量单位，溶解于缓冲液或(NH₄)₂SO₄悬浮液中)
    • 氯化铵 (NH₄Cl) 溶液 (50-100 mM, 提供GDH反应所需的NH₄⁺)
    • 反应终止液 (可选)：如3 M乙酸或20%三氯乙酸(TCA)，用于固定时间点法。
  • 仪器设备：
    • 紫外-可见分光光度计 (配备恒温比色槽)
    • 石英比色皿 (光程1 cm)
    • 恒温水浴锅
    • 高速冷冻离心机
    • 移液器及枪头
    • 计时器
    • 冰盒
 

四、操作步骤 (连续监测法)

  1. 预热： 开启分光光度计，设定波长340 nm，将比色槽恒温至反应温度（通常为25℃或30℃）。预热所有试剂至反应温度。
  2. 配制反应混合液 (总体积通常1 mL)： 在比色皿中依次加入：
    • 适量缓冲液 (如700-800 μL 100 mM Tris-HCl, pH 7.8)
    • 谷氨酰胺溶液 (如100 μL 50 mM Gln, 终浓度5 mM)
    • 氯化铵溶液 (如100 μL 50 mM NH₄Cl, 终浓度5 mM) [注：此步主要提供GDH所需NH₄⁺]
    • 谷氨酸脱氢酶溶液 (适量，如10-20 U, 确保能快速消耗残留α-KG)
    • NADH溶液 (如50 μL 3 mM NADH, 终浓度~0.15 mM)
    • 混匀，放入分光光度计中平衡温度2-3分钟。
  3. 基线测定： 读取并记录340 nm处的吸光度作为初始值(A₀)，或监测几分钟确保基线稳定（吸光度下降极小且线性）。
  4. 启动反应： 迅速加入：
    • α-酮戊二酸溶液 (如50 μL 20 mM α-KG, 终浓度1 mM)
    • 立即混匀并开始计时。
  5. 监测反应： 连续记录340 nm处吸光度随时间下降的变化，持续3-10分钟（确保在线性下降区间内）。记录时间(t)和对应的吸光度(Aₜ)。
  6. 加入酶液： 为测定样品活性，在上述步骤4启动反应（加入α-KG）后，迅速加入适量酶液（如20-100 μL粗酶提取液，根据预估活性调整体积），立即混匀并开始计时，监测吸光度下降。同时设置空白对照：用等体积提取缓冲液代替酶液，或在反应体系中去除某一关键底物（如α-KG或Gln）。空白反应的下降速率需从样品反应速率中扣除。
  7. 终止反应 (仅固定时间点法)： 若采用固定时间点法（非连续监测），则在反应启动后精确反应一定时间（如5-15分钟），加入终止液（如100 μL 20% TCA）终止反应，离心后取上清测定NADH剩余量（需另做标准曲线）。此法误差较大，推荐连续监测法。
 

五、结果计算

  1. 计算反应速率 (ΔA/min)：
    • 从记录的吸光度-时间曲线中，选取线性下降的部分（通常反应开始后的1-5分钟）。
    • 计算吸光度下降的斜率：ΔA/min = (A₁ - A₂) / (t₂ - t₁)
      • A₁, A₂：时间点t₁, t₂对应的吸光度值 (A₁ > A₂)。
    • 扣除空白： 样品ΔA/min (样品) = ΔA/min (样品管) - ΔA/min (空白管)
  2. 计算酶活性：
    • GOGAT活性单位(U)定义为：在测定条件下，每分钟氧化1 μmol NADH所需的酶量。
    • 计算公式：
      酶活性 (U/mL 或 U/mg prot) = (ΔA/min * V_t * DF) / (ε * d * V_e * P_c)
      • ΔA/min：扣除空白后的吸光度下降速率 (min⁻¹)
      • V_t：反应体系总体积 (mL) (如1.0 mL)
      • DF：样品稀释倍数 (若酶液是稀释后的)
      • ε：NADH在340 nm处的摩尔消光系数 (6.22 mM⁻¹ cm⁻¹ = 6220 M⁻¹ cm⁻¹)
      • d：比色皿光程 (cm) (通常为1 cm)
      • V_e：加入反应体系中的酶液体积 (mL)
      • P_c：酶液的蛋白浓度 (mg prot/mL) (如果计算比活力U/mg prot)。如果计算总活性或体积活性(U/mL酶液)，则此项为1。
    • 简化理解： 公式的核心部分是 ΔA/min / (ε * d) 计算出每分钟反应消耗的NADH摩尔数(μmol/min/mL反应体系)，再乘以反应体系总体积(V_t)得到每分钟反应消耗的总NADH摩尔数(μmol/min)，然后除以加入的酶量(V_e * P_c)并考虑稀释倍数(DF)，最终得到比活力(U/mg prot)或体积活性(U/mL酶液)。
 

六、方法学要点与注意事项

  1. 酶液制备： 操作全程在冰上进行，使用预冷的提取缓冲液和离心机，尽快完成提取和测定，以保持酶活性稳定。添加蛋白酶抑制剂有助于防止酶降解。
  2. 底物浓度优化： 反应体系中底物浓度（尤其是Gln和α-KG）需在饱和浓度以上，以保证反应速度仅由酶浓度决定。建议进行预实验确定合适的底物浓度范围。
  3. NADH稳定性： NADH对光、热、pH敏感，需临用前配制并避光保存于冰上。高pH会加速其分解。空白反应速率应较低（通常<0.005 ΔA/min）。
  4. GDH的作用： 加入GDH和NH₄⁺是为了快速消耗反应体系中未被GOGAT利用的α-KG，避免其在后续反应中与NADH非特异性反应（尤其在反应后期或酶活性低时）导致背景升高。确保加入足量GDH。
  5. 线性范围： 必须确保测定的吸光度下降速率在线性区间内（即ΔA/min基本恒定）。反应时间过长或酶量过高可能导致底物耗尽或偏离线性。应调整酶液加入量使ΔA/min在0.01-0.1之间较为理想。
  6. 严格设置空白： 空白对照至关重要，用于扣除非GOGAT引起的NADH氧化（如酶液中脱氢酶杂质、NADH自发氧化等）。常用空白包括：不加α-KG（但需加GDH和NH₄⁺），或不加Gln。
  7. 温度控制： 反应温度需精确控制，温度波动会影响反应速率。使用带恒温装置的比色槽。
  8. 离子影响： 某些金属离子可能影响酶活，提取和反应缓冲液中常含有螯合剂（EDTA/EGTA）。
  9. 样品活性范围： 若样品活性过低，可延长监测时间或增加酶量；若活性过高，则需稀释酶液或减少加入量。
  10. 数据记录： 详细记录所有试剂浓度、反应体系体积、加入体积、反应温度、时间、吸光度值、蛋白浓度等参数，确保结果可追溯和重复。
 

七、应用与意义

本方法适用于多种生物样本（植物组织、细菌、真菌、藻类等）中GOGAT活性的定量分析。通过测定不同生理状态（如不同氮源供应、胁迫条件、发育阶段、基因突变/过表达）或不同组织/器官中的GOGAT活性变化，可以：

  • 评估生物体氮同化效率。
  • 研究氮代谢调控网络及关键酶的作用。
  • 揭示植物对氮肥响应的生理机制。
  • 探究微生物固氮及氮循环过程。
  • 筛选和鉴定与氮代谢相关的突变体或转基因材料。
  • 为作物氮高效育种或微生物菌剂开发提供理论依据。
 

结论

谷氨酸脱氢酶(GDH)偶联的连续监测法是一种灵敏、可靠且广泛应用的GOGAT活性检测方法。严格遵循操作规程，注意控制关键影响因素（如酶液稳定性、底物饱和、NADH稳定性、线性范围、空白设置和温度），是获得准确、可重复结果的关键。该方法为深入探究生物体氮代谢生理与调控机制提供了重要的技术支撑。

(主要参考文献：方法学原理主要依据植物生理学及酶学标准方法，可参考早期建立该方法的文献如 Matoh & Takahashi, 1982; Suzuki et al., 1982 等及其后续改进方案。)