脲酶(UE)活性检测

发布时间：2025-06-28 08:01:39 阅读量：1 作者：生物检测中心

脲酶（Urease， UE）活性检测方法详解

一、 检测原理

脲酶（Urease， EC 3.5.1.5）是一种广泛存在于微生物、植物和动物组织中的镍依赖酶，能专一性催化尿素水解生成氨和氨基甲酸，后者可自发分解为另一分子氨和二氧化碳：

(NH₂)₂CO + H₂O → 2NH₃ + CO₂

脲酶活性检测的核心即定量测定上述反应中生成的氨。目前公认且应用最广泛的方法是Berthelot比色法或其改良方法：

  1. 酶促反应：在适宜条件下（通常为pH 7.0， 37°C），脲酶催化底物尿素水解，生成氨（NH₃/NH₄⁺）。
  2. 氨的显色定量：
    • 氨在碱性介质中与次氯酸盐（或次溴酸盐）反应生成氯胺（或溴胺）。
    • 氯胺（或溴胺）迅速与苯酚（或水杨酸、硝普钠等）反应，生成稳定的靛酚蓝（Indophenol Blue）或类似蓝色复合物。
    • 该蓝色物质在特定波长（通常在625-640 nm附近）有最大吸收峰。
    • 其蓝色的深浅与反应生成的氨量（即脲酶活性）成正比，通过测定该波长下的吸光度（A），即可推算氨的生成量。
 

二、 主要检测方法

基于上述原理，实践中主要采用以下两种模式：

  1. 终点法 (Fixed Time Assay):

    • 原理： 让酶促反应在严格控制的条件下（温度、pH、时间）进行一段固定的时间（通常为数分钟至数十分钟），然后加入终止液（通常是酸性溶液或含显色剂的混合液）彻底终止酶反应，并同时或随后启动显色反应。待显色完成后，测定吸光度。
    • 优点： 操作相对简单，一次可处理较多样品，对仪器要求相对较低。
    • 缺点： 需要精确控制反应时间，对于活性极高的样品，可能在设定的反应时间内底物消耗过多，导致结果偏离线性范围。

  2. 动力学法 / 速率法 (Kinetic Assay / Rate Assay):

    • 原理： 在酶促反应起始的同时或之后不久即加入显色试剂（确保显色反应速率远快于酶促反应速率），利用分光光度计连续监测反应体系在特定波长下吸光度随时间的变化（ΔA/min）。吸光度的变化速率（斜率）直接反映氨的生成速率，即脲酶活性。
    • 优点： 结果更准确反映酶促反应的初始速率，不易受底物过度消耗的影响，线性范围更宽，自动化程度高。
    • 缺点： 对仪器要求较高（需恒温比色装置和动力学测量功能），数据处理稍复杂。
 

三、 所需试剂与材料

  • 缓冲液： 常用磷酸盐缓冲液（如0.1 M, pH 7.0）或Tris-HCl缓冲液（如0.05 M, pH 7.0），用于维持稳定的反应pH环境。
  • 尿素溶液： 底物溶液（常用浓度范围0.1 M - 1.0 M），用对应缓冲液新鲜配制。浓度选择需确保其在反应时间内不过度消耗（一般消耗<10%）。
  • 显色试剂（Berthelot试剂）： 通常包含两种主要组分：
    • 酚试剂： 苯酚（或水杨酸、硝普钠）的碱性溶液（常用NaOH配制）。
    • 次氯酸盐试剂： 碱性次氯酸钠（或次溴酸钠）溶液。 两种试剂在使用前按体积比混合或分别加入反应体系。配方比例需优化。
  • 终止液（仅终点法需要）： 强酸溶液（如2 M HCl）或含有显色剂的混合酸性溶液，用于终止酶反应并启动显色。
  • 氨标准溶液： 氯化铵（NH₄Cl）或硫酸铵配制的一系列已知浓度的标准溶液（如0、0.05、0.1、0.2、0.3 mM氨），用于制作标准曲线。
  • 样品： 待测的含脲酶溶液（如细菌培养物上清、组织匀浆上清、纯酶液等），需进行适当稀释。固体样品需提取。
  • 仪器：
    • 恒温水浴锅（终点法）或带恒温控制的紫外-可见分光光度计（动力学法）
    • 分光光度计
    • 计时器
    • 移液器及枪头
    • 比色皿（通常为1 cm光径玻璃或石英比色皿）
    • 试管或微孔板（根据检测规模选择）
 

四、 标准操作步骤示例（终点法）

以下流程为通用参考，具体浓度、体积、时间等参数需根据实际样品活性进行调整和优化。

  1. 准备工作：

    • 预热恒温水浴锅至37°C。
    • 配制所需试剂（缓冲液、尿素溶液、显色试剂、终止液、氨标准系列）。
    • 按要求稀释待测样品和标准品。

  2. 制作标准曲线（平行测定）：

    • 取一系列试管，分别加入不同浓度的氨标准溶液（如0, 20, 40, 60, 80, 100 μL 的0.3 mM NH₄⁺标准液）。
    • 用缓冲液补足至相同体积（如100 μL）。
    • 向每管加入适量缓冲液（如1.8 mL）。
    • 充分混匀后，加入混合好的显色试剂（或先加酚试剂混匀，再加次氯酸盐试剂）（如1.0 mL）。
    • 立即混匀，37°C避光显色15-30分钟（时间需固定）。
    • 在625-640 nm波长下，以试剂空白（0浓度标准管）调零，测定各管的吸光度（A_standard）。

  3. 样品测定（平行测定）：

    • 酶促反应：
      • 取试管，加入适量缓冲液（如900 μL）。
      • 加入稀释好的样品溶液（如100 μL），轻轻混匀。
      • 37°C水浴预热5分钟。
      • 加入预热好的尿素底物溶液（如1.0 mL），立即混匀并开始计时。
      • 37°C水浴中精确反应10分钟（时间需严格控制）。
    • 终止与显色：
      • 加入终止液（如2 mL， 含显色剂或仅终止）或直接加入显色试剂（如酚试剂和次氯酸盐试剂各1.0 mL），立即充分混匀以终止酶反应并启动显色。
      • 37°C避光显色15-30分钟（时间需与标准曲线一致）。
    • 测定吸光度： 在625-640 nm波长下，以试剂空白（用缓冲液代替样品，其他步骤相同）调零，测定样品管的吸光度（A_sample）。同时测定仅含样品但不加尿素的“样品空白”管（用于扣除样品本身氨背景）吸光度（A_blank）。

  4. 数据处理与计算：

    • 绘制标准曲线： 以氨标准溶液的浓度（或总氨量）为横坐标（X），对应的吸光度（A_standard）为纵坐标（Y），绘制标准曲线。通常得到一条通过原点或接近原点的直线，拟合线性回归方程：y = kx + b （y为吸光度A， x为氨浓度或氨量）。
    • 计算样品氨生成量：
      • 样品净吸光度 ΔA = A_sample - A_blank
      • 根据标准曲线方程，代入ΔA值，计算出样品管反应液中由尿素水解产生的氨浓度 C_NH3 (mM) 或氨量 N_NH3 (μmol)。
    • 计算脲酶活性：
      • 定义：通常以单位时间（min）内，单位质量的酶（mg蛋白质）或单位体积的样品（mL发酵液、g鲜重组织等）催化产生的氨量（μmol NH₃）来表示。
      • 公式：
        脲酶活性 (U/mg prot 或 U/mL 或 U/g) = (N_NH3 * V_t * D) / (t * V_e * M)
        • N_NH3：由ΔA计算得到的样品管中生成的氨的量（μmol）
        • V_t：酶促反应终止时的总体积（mL， 即反应液体积 + 终止液/显色试剂体积。注意：若显色在更大体积下进行，需换算）
        • D：样品的稀释倍数（从原始样品到加入反应体系的稀释步骤）
        • t：酶促反应时间（min）
        • V_e：加入反应体系中的样品体积（mL）
        • M：换算因子。若活性表示为：
          • U/mL (原始样品)：M = 1
          • U/mg prot：M 为加入反应体系中的样品所含的蛋白质浓度（mg prot/mL）。需提前用Bradford、BCA或Lowry等方法测定样品蛋白浓度。
          • U/g (鲜/干重)：M 为加入反应体系中的样品对应的组织质量（g/mL）。需知道提取液的体积与原始组织质量的关系。
      • 单位： 最常用的是 μmol NH₃/min/mg prot 或 μmol NH₃/min/mL。
      • *关键点： 务必注意体积和时间单位的一致性（通常体积用mL或μL，时间用min，氨量用μmol）。
 

五、 注意事项与质量控制

  1. 优化反应条件： 尿素浓度、酶液浓度/用量、反应pH、反应温度、反应时间需优化，确保反应速率在线性范围内（底物消耗不超过10%，吸光度变化与时间成正比）。
  2. 精确计时： 尤其是终点法，反应时间和显色时间必须精确控制并保持一致。
  3. 试剂稳定性： 尿素溶液易缓慢分解，建议新鲜配制或冷冻保存。酚试剂和次氯酸盐试剂不稳定，需避光冷藏保存，并在有效期内使用（通常1-2周）。显色试剂配制后需静置或预反应一段时间（如30分钟）使其稳定。
  4. 干扰物质： 某些样品可能含有内源性氨、酚类或具有还原性的物质，可能干扰显色反应或背景值。设置“样品空白”（不加尿素）至关重要。必要时可进行透析除盐、去蛋白等预处理。
  5. pH控制： 显色反应需在强碱性条件下进行，缓冲液pH需精确配制。加入显色试剂后体系的最终碱度需满足显色要求。
  6. 温度控制： 酶促反应和显色反应均需严格控制温度（通常37°C±0.2°C）。
  7. 显色稳定性： 蓝色产物在一定时间内稳定，但长时间放置可能褪色。应在显色完成后尽快测定吸光度。
  8. 平行测定： 样品和标准品均需进行充分的平行测定（建议至少3次重复）。
  9. 标准曲线： 每次实验必须制作新鲜的标准曲线，特别是使用新配制的显色试剂时。
  10. 仪器校正： 确保分光光度计波长和吸光度准确。
 

六、 应用领域

脲酶活性检测在多个领域具有重要应用价值：

  • 微生物学： 鉴定产脲酶细菌（如幽门螺杆菌、变形杆菌、尿素分解菌等），研究微生物的氮代谢。
  • 酶学与生物化学： 脲酶纯化、性质研究（最适pH、温度、Km、Vmax）、抑制剂筛选与机理研究。
  • 农业与环境科学：
    • 评估土壤中尿素分解速率及脲酶活性对氮肥利用效率、氨挥发损失的影响。
    • 研究有机肥料、堆肥中微生物的尿素降解能力。
    • 监测水体、沉积物中的尿素污染及生物降解过程。
  • 食品科学： 检测豆类（尤其是大豆及其制品）中的脲酶残留活性，作为抗营养因子（胰蛋白酶抑制剂）失活程度的指示指标（脲酶活性与胰蛋白酶抑制剂活性正相关）。
  • 医学诊断： 快速脲酶试验（如CLO试验）是诊断幽门螺杆菌感染的常用方法之一（利用胃活检组织中的脲酶分解尿素产氨导致pH升高指示剂变色）。
  • 工业生物技术： 筛选高效产脲酶菌株用于生物脱氮、生物矿化（碳酸钙沉淀）等应用。
 

总结

脲酶活性检测主要基于其催化尿素水解生成氨的特性，通过Berthelot比色法定量氨的生成量来反映酶活性。终点法和动力学法是两种主要操作模式。成功检测的关键在于严格控制反应条件（pH、温度、时间）、使用新鲜稳定的试剂、设置必要的空白对照、制作准确的标准曲线，并进行正确的数据处理。该方法在基础研究、医学诊断、农业环境及食品安全等多个领域具有广泛应用。严格按照操作规程和质量控制要求进行，可获得可靠、可重复的脲酶活性数据。