硫氧还蛋白过氧化物酶(TPX)活性检测

发布时间：2025-06-28 08:01:39 阅读量：2 作者：生物检测中心

硫氧还蛋白过氧化物酶(TPX)活性检测方案

一、 引言
硫氧还蛋白过氧化物酶(Thioredoxin Peroxidase, TPX)是过氧化物酶超家族的重要成员，利用还原型硫氧还蛋白(Trx)作为电子供体，催化过氧化氢(H₂O₂)等活性氧的还原，在细胞抗氧化防御和氧化还原信号传导中发挥核心作用。本方案详细描述了基于还原型硫氧还蛋白(Trx)还原5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)显色原理的TPX活性分光光度检测方法。

二、 检测原理

  1. TPX催化反应： TPX利用还原态硫氧还蛋白(Trx-(SH)₂)提供的电子，还原过氧化氢(H₂O₂)生成水(H₂O)。同时，Trx-(SH)₂被氧化成氧化态硫氧还蛋白(Trx-S₂)。
    TPx + Trx-(SH)₂ + H₂O₂ → TPx + Trx-S₂ + 2H₂O
  2. Trx还原系统（背景反应）： 还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)在硫氧还蛋白还原酶(TrxR)催化下，将氧化态硫氧还蛋白(Trx-S₂)重新还原为还原态(Trx-(SH)₂)，维持反应体系中Trx的还原能力。
    TrxR + Trx-S₂ + NADPH + H⁺ → TrxR + Trx-(SH)₂ + NADP⁺
  3. DTNB显色反应（监测反应）： 剩余的过量还原态硫氧还蛋白(Trx-(SH)₂)能够还原DTNB，生成黄色的5-硫代-2-硝基苯甲酸阴离子(TNB²⁻)，该物质在412 nm波长处具有显著光吸收。
    Trx-(SH)₂ + DTNB → Trx-S₂ + 2TNB⁻ (黄色) + 2H⁺
  4. TPX活性与吸光度变化的关系： 在包含TrxR、NADPH、Trx-(SH)₂和H₂O₂的反应体系中加入TPX样品。TPX活性越高，消耗的Trx-(SH)₂越多，剩余的Trx-(SH)₂就越少，导致后续与DTNB反应生成的TNB²⁻越少，在412 nm处测得的吸光度增量(ΔA₄₁₂/min)就越低。因此，TPX活性与ΔA₄₁₂/min呈负相关。通过监测加入DTNB后体系吸光度的下降速率（即ΔA₄₁₂/min的负值），即可计算TPX活性。
 

三、 试剂与溶液配制

  • 重要提示： 所有溶液均需使用高纯度试剂和超纯水(如18.2 MΩ·cm)配制。
  • 1. 反应缓冲液 (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 含1 mM EDTA)：
    • 称取6.057 g三羟甲基氨基甲烷(Tris)和0.372 g乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA-Na₂)，溶于约800 mL超纯水中。
    • 用浓盐酸调节pH至7.5 (25°C)。
    • 定容至1 L。4°C储存。
  • 2. EDTA溶液 (10 mM)： 称取0.0372 g EDTA-Na₂溶于10 mL超纯水中。4°C储存。
  • 3. NADPH溶液 (2 mM)： 准确称取适量还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐(NADPH-Na₂)，溶于反应缓冲液（或10 mM EDTA溶液）中，配制成2 mM溶液。现用现配，避光冰浴。
  • 4. 硫氧还蛋白还原酶(TrxR)溶液： 根据酶源说明（如大肠杆菌重组酶、大鼠肝脏提取物等），用反应缓冲液稀释至适宜工作浓度（通常使反应速率在检测范围内）。分装后-20°C或-80°C冻存，避免反复冻融。
  • 5. 还原态硫氧还蛋白(Trx-(SH)₂)溶液 (10 µM)：
    • 原料：氧化态硫氧还蛋白(Trx-S₂)。
    • 还原方法：取适量Trx-S₂，溶于含10 mM二硫苏糖醇(DTT)的反应缓冲液中，室温孵育30分钟。
    • 去除DTT：立即将反应液转移至预平衡好的脱盐柱（如Sephadex G-25），用反应缓冲液洗脱，收集含还原态Trx-(SH)₂的组分（可通过A₂₈₀监测蛋白峰）。
    • 浓度测定：使用Trx-(SH)₂的摩尔消光系数计算浓度（需查阅所用Trx的具体系数）。
    • 稀释：用反应缓冲液稀释至10 µM工作液。必须现用现配，并在冰上操作，严格隔绝空气以防氧化。
  • 6. DTNB溶液 (10 mM)： 称取3.963 mg 5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)，溶于1 mL反应缓冲液中（可微热助溶），避光保存。4°C可稳定数周。
  • 7. 过氧化氢(H₂O₂)工作液 (500 µM)： 取适量30%过氧化氢溶液（浓度约为9.79 M），用超纯水精确稀释500倍（例如：2 µL 30% H₂O₂ 加入9.998 mL 水），配制成约500 µM溶液。现用现配，冰浴避光。
  • 8. 待测样品： 含TPX的样品（如细胞裂解液、组织匀浆上清、纯化酶液等）。样品应溶于或透析/稀释于反应缓冲液（或低盐缓冲液）中。测定前需明确样品中的蛋白浓度（常用Bradford法或BCA法）。
 

四、 仪器设备

  1. 紫外-可见分光光度计（带恒温比色皿架）
  2. 精密移液器及配套吸头
  3. 秒表
  4. 恒温水浴锅（可选，用于预温）
  5. 玻璃或石英比色皿（光径1 cm）
  6. 冰盒
  7. 涡旋混合器
  8. 超纯水系统
  9. pH计
  10. 脱盐柱及相关设备（如需要自制还原态Trx）
 

五、 检测步骤（以1 mL反应体系为例）

  1. 仪器预热与设定： 开启分光光度计，设定检测波长为412 nm。预热恒温比色皿架至25°C（或实验指定温度）。
  2. 空白对照反应体系 (Blank) 配制（于比色皿中进行）：
    • 加入700 µL 反应缓冲液。
    • 加入100 µL NADPH溶液 (2 mM, 终浓度0.2 mM)。
    • 加入50 µL TrxR工作液。
    • 加入50 µL 还原态Trx-(SH)₂溶液 (10 µM, 终浓度0.5 µM)。
    • 加入100 µL 超纯水（代替样品和H₂O₂）。
    • 轻轻混匀，置于恒温比色皿架中平衡3-5分钟。
  3. 样品反应体系 (Sample) 配制（于比色皿中进行）：
    • 加入690 µL 反应缓冲液（比Blank少10 µL，用于加样品）。
    • 加入100 µL NADPH溶液 (2 mM)。
    • 加入50 µL TrxR工作液。
    • 加入50 µL 还原态Trx-(SH)₂溶液 (10 µM)。
    • 加入10 µL 待测样品（根据预实验调整加入量，使反应速率适中）。
    • 轻轻混匀，置于恒温比色皿架中平衡3-5分钟。
  4. 启动反应与监测背景消耗：
    • 向Blank和Sample比色皿中分别加入50 µL H₂O₂工作液 (500 µM, 终浓度25 µM)，立即轻柔混匀并开始计时。
    • 立即将比色皿放入光度计，连续监测412 nm处吸光度(A₄₁₂)的变化约2-3分钟，记录稳定的基线下降速率 (ΔA₄₁₂/min)bkgd。此速率代表除TPX外系统中所有消耗NADPH的背景反应。
  5. 启动DTNB显色与监测TPX活性：
    • 向Blank和Sample比色皿中分别加入50 µL DTNB溶液 (10 mM, 终浓度0.5 mM)，立即轻柔混匀。
    • 迅速将比色皿放回光度计，立即开始连续记录412 nm处吸光度变化至少3-5分钟（确保获得线性良好的下降曲线）。
    • 精确记录吸光度下降的起始点（加DTNB后第一次读数）和时间点。
  6. 计算反应速率： 选取加DTNB后吸光度随时间线性下降的阶段（通常30-120秒后），计算每分钟吸光度的变化值 (ΔA₄₁₂/min)sample 和 (ΔA₄₁₂/min)blank。
 

六、 数据处理与计算

  1. 计算TPX引起的特异性速率变化：
    ΔA₄₁₂/min (TPX) = [ΔA₄₁₂/min (blank) - ΔA₄₁₂/min (sample)]
    • 此值代表了扣除背景消耗后，由TPX活性导致的吸光度下降速率（正值）。
  2. 计算TPX活性：
    • 依据消光系数： TNB²⁻在412 nm处的摩尔消光系数 ε₄₁₂ = 13,600 M⁻¹ cm⁻¹。
    • 单位定义： 1单位(U) TPX活性定义为：在测定条件下（25°C, pH 7.5），每分钟催化氧化1 µmol 还原态Trx所需的酶量。
    • 活性计算公式：
      TPX活性 (U/mL) = [ΔA₄₁₂/min (TPX) * V_t * DF] / (ε * d * V_s)
      TPX比活性 (U/mg prot) = [TPX活性 (U/mL)] / [样品蛋白浓度 (mg/mL)]
      • ΔA₄₁₂/min (TPX): TPX引起的每分钟吸光度变化（正值，无量纲）
      • V_t: 反应体系总体积 (mL) (本方案为1.05 mL，需精确计算：700+100+50+50+10+50+50=1010 µL ≈ 1.01 mL，请按实际加入体积计算)
      • DF: 样品稀释倍数 (若样品为粗提液，需考虑其稀释倍数)
      • ε: TNB²⁻的摩尔消光系数 (13,600 M⁻¹ cm⁻¹)
      • d: 比色皿光径 (cm) (通常为1 cm)
      • V_s: 加入反应体系中的样品体积 (mL) (本方案为0.01 mL)
 

七、 注意事项

  1. 还原态Trx-(SH)₂稳定性： 极易被空气氧化，务必现还原现用，制备和使用过程保持低温（冰浴），操作迅速，尽量避免接触空气。这是实验成功的关键。
  2. NADPH稳定性： NADPH溶液不稳定，对光、空气和温度敏感。必须现用现配，避光冰浴保存。
  3. H₂O₂稳定性： H₂O₂工作液易分解，尤其在碱性环境和金属离子存在下。必须现用现配，避光冰浴保存。使用前可用紫外分光法（ε₂₄₀ = 43.6 M⁻¹ cm⁻¹）标定浓度。
  4. 酶浓度控制： 确保加入的TrxR和TPX样品量能使反应初速度维持在线性范围内（ΔA₄₁₂/min随时间线性下降）。通常ΔA₄₁₂/min (blank) 控制在0.05-0.15 /min为宜。
  5. 温度控制： 酶促反应对温度敏感，务必保持恒温（如25°C）。
  6. 背景扣除： 严格设置空白对照（不加样品和H₂O₂）以扣除系统背景消耗。
  7. 样品处理： 粗提样品可能含有内源性NADPH、Trx、TrxR或其他干扰物质。需要优化样品用量或进行透析/脱盐处理。测定样品蛋白浓度时确保与反应缓冲液兼容。
  8. 线性范围： 确保监测的ΔA₄₁₂/min在线性下降阶段（R² > 0.99）。反应起始阶段（加DTNB后前30秒）可能因混合不均或溶液粘度导致非线性，数据处理时应避开。
  9. 试剂纯度： 使用高纯度试剂，特别是DTT和DTNB。
  10. 安全防护： 操作H₂O₂、浓酸碱、DTNB粉末时需佩戴手套、护目镜并在通风橱内进行。
 

八、 方法特点与应用
本方法基于经典的硫氧还蛋白系统耦合DTNB显色，具有原理明确、操作相对简便、无需特殊昂贵仪器（分光光度计即可）的优点，是检测TPX（特别是哺乳动物Prx I-IV等典型2-Cys Prx）活性的常用方法。适用于：

  • 纯化TPX/Prx酶动力学研究（Km, Vmax, Kcat）
  • 细胞或组织提取物中TPX/Prx总活性的测定
  • 药物、抗氧化剂、环境因子等对TPX/Prx活性影响的研究
  • 不同生理/病理状态下生物样本TPX/Prx活性的比较
 

通过严谨的操作和严格的质量控制，此方案可为研究硫氧还蛋白过氧化物酶在氧化还原平衡及相关疾病中的作用提供可靠的工具。