谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活性检测

发布时间：2025-06-28 08:01:39 阅读量：1 作者：生物检测中心

谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）活性检测方法详解

一、 引言

谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione Peroxidase, GPX， EC 1.11.1.9）是一类重要的含硒（部分同工酶不含硒）抗氧化酶，在生物体的抗氧化防御系统中扮演核心角色。其主要功能是催化还原型谷胱甘肽（GSH）还原脂质氢过氧化物（LOOH）和过氧化氢（H₂O₂），生成氧化型谷胱甘肽（GSSG）和相应的醇或水。该过程有效清除有害的活性氧（ROS），保护细胞膜、蛋白质和核酸免受氧化损伤。准确测定GPX活性对于评估生物体的氧化应激水平、研究抗氧化剂功效、探究疾病（如神经退行性疾病、心血管疾病、癌症等）的氧化损伤机制以及环境毒理学研究等至关重要。

二、 检测原理（NADPH 偶联法）

目前最常用且可靠的GPX活性检测方法是基于谷胱甘肽还原酶（Glutathione Reductase, GR）偶联的NADPH消耗法。其核心原理如下：

  1. GPX 催化反应： GPX 催化底物（通常为叔丁基过氧化氢或H₂O₂）被还原型谷胱甘肽（GSH）还原，同时生成氧化型谷胱甘肽（GSSG）和水或醇。
    ROOH + 2GSH → GSSG + ROH + H₂O (ROOH 代表有机氢过氧化物或 H₂O₂)

  2. GR 偶联反应： 反应生成的 GSSG 在谷胱甘肽还原酶（GR）的作用下，利用还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）作为还原当量供体，被还原回两分子的 GSH。此过程伴随 NADPH 被氧化成 NADP⁺。
    GSSG + NADPH + H⁺ → 2GSH + NADP⁺

  3. NADPH 消耗监测： NADPH 在 340 nm 波长处具有特征性吸收峰。随着偶联反应的进行，NADPH 不断被消耗，导致反应体系中 340 nm 处的吸光度（A₃₄₀）随时间下降。NADPH 消耗的速率与 GPX 催化反应的速率成正比。

  4. 活性计算： 因此，通过连续监测反应体系在 340 nm 处吸光度下降的速率（ΔA₃₄₀ / min），即可推算出 GPX 的酶活性。单位时间内吸光度下降得越快，表明 GPX 活性越高。

 

三、 所需试剂与材料

  • 缓冲液： 适合GPX活性的反应缓冲液（如磷酸盐缓冲液 PBS， 50-100 mM， pH 7.0-7.8），通常含 EDTA（~1 mM）以螯合金属离子。
  • 谷胱甘肽还原酶（GR）： 纯化的谷胱甘肽还原酶。
  • 还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）： 还原型辅酶。
  • 还原型谷胱甘肽（GSH）： 底物之一。
  • 底物（过氧化物）： 常用叔丁基过氧化氢（t-BOOH， 如 30-50 mM 储备液）或过氧化氢（H₂O₂， 如 50-100 mM 储备液）。选择需考虑GPX同工酶特异性及稳定性（H₂O₂易分解）。
  • 叠氮钠（NaN₃）： （可选，~1 mM）用于抑制样品中可能存在的过氧化氢酶活性（若使用H₂O₂作底物）。
  • 待测样品： 组织匀浆上清液、细胞裂解液、血清/血浆、或纯化酶液。样品需适当制备（如匀浆、离心去除碎片、测定蛋白浓度）。
  • 蛋白浓度测定试剂： （如 Bradford 法试剂）用于标准化酶活性。
  • 蒸馏水或去离子水： 配制所有溶液。
 

四、 实验步骤（示例）

  1. 样品制备：

    • 组织样本：精确称取组织，加入适量预冷的匀浆缓冲液（如 PBS），冰浴下充分匀浆。离心（如 10,000-15,000 × g, 4°C, 15-30 min），取上清液作为待测样品。
    • 细胞样本：收集细胞，PBS洗涤，加入适量裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解。离心（如 10,000 × g, 4°C, 10 min），取上清液。
    • 血清/血浆：可直接使用或适当稀释。
    • 测定所有待测样品的蛋白质浓度（如 Bradford 法）。

  2. 反应体系配制（以 1 ml 反应体系为例，体积可等比例缩放）：

    • 在比色杯（光程 1 cm）或微孔板孔中加入：
      • 缓冲液：补充至终体积。
      • GSH：终浓度 1-5 mM。
      • GR：适量活性单位（通常按试剂说明或预实验确定，确保反应速率由GPX决定）。
      • NADPH：终浓度约 0.15-0.25 mM（吸光度起始值在 0.8-1.0 AU 左右为宜）。
      • 叠氮钠：（若使用H₂O₂）终浓度约 1 mM。
      • 待测样品：适量体积（通常使反应速率在线性范围内，预实验确定）。空白管用缓冲液或样品稀释液代替样品。
    • 轻轻混匀，置于设定为 25°C 或 37°C 的分光光度计或酶标仪样品室中，预温育 3-5 分钟。

  3. 启动反应与监测：

    • 加入预温的底物（t-BOOH 或 H₂O₂）启动反应。终浓度通常为：
      • t-BOOH: 0.5-1.5 mM
      • H₂O₂: 0.1-0.5 mM (浓度过高可能抑制酶活或产生非酶促反应)。
    • 立即开始计时，在 340 nm 波长下，连续监测吸光度（A₃₄₀）的变化至少 3-5 分钟（通常每分钟记录一次读数），确保反应速率在线性下降阶段（ΔA₃₄₀/min 恒定）。

  4. 空白对照： 同时设置两种空白对照：

    • 样品空白（非酶促对照）： 不含底物（t-BOOH/H₂O₂）的反应体系（加样品），用于校正样品本身可能的 NADPH 消耗。
    • 试剂空白： 不含样品（用缓冲液代替）和底物的反应体系，用于校正 NADPH 的非酶降解或光漂白（通常变化极小）。
 

五、 数据处理与活性计算

  1. 计算吸光度变化速率：

    • 使用监测数据，以时间（min）为横坐标，A₃₄₀ 为纵坐标作图。
    • 选取线性下降阶段（通常是最初的 1-3 分钟），计算其斜率（ΔA₃₄₀ / min）。
    • 对于样品管（含底物）：斜率 = ΔA_sample / min
    • 对于样品空白管（不含底物）：斜率 = ΔA_sample_blank / min

  2. 计算校正后的酶促反应速率：
    ΔA_corrected / min = | (ΔA_sample / min) - (ΔA_sample_blank / min) |
    （取绝对值，因为速率是下降的）

  3. 计算酶活性单位：
    GPX 活性通常定义为：在特定反应条件下（温度、pH），每分钟催化消耗 1 μmol NADPH 所需的酶量。

    • 摩尔消光系数（ε）： NADPH 在 340 nm 处的摩尔消光系数为 6.22 × 10³ L mol⁻¹ cm⁻¹ (适用于光程 1 cm 的比色杯)。对于微孔板，需根据实际光程校正或使用厂家提供的校正值。
    • 活性计算公式：
      GPX 活性 (U/mL) = [ (ΔA_corrected / min) × V_t × DF ] / (ε × d × V_s × t)
      • ΔA_corrected / min：校正后的每分钟吸光度变化值。
      • V_t：反应体系总体积（单位：mL，如 1 mL）。
      • DF：样品在反应体系中的稀释倍数（例如，若反应体系中样品体积是0.1 mL，样品原始浓度为10 mg蛋白/mL，则 DF = V_t / V_s = 1 / 0.1 = 10，但通常指样品在反应前被稀释的倍数）。
      • ε：NADPH 在 340 nm 的摩尔消光系数（6.22 × 10³ L mol⁻¹ cm⁻¹ = 6.22 × 10³ mL μmol⁻¹ cm⁻¹，因为 1 L = 1000 mL, 1 mol = 10⁶ μmol）。
      • d：比色杯光程（单位：cm，标准比色杯为 1 cm；酶标板需查实际光程）。
      • V_s：反应体系中加入的样品体积（单位：mL）。
      • t：时间单位（min），因为 ΔA/min 已经包含每分钟，所以此处 t = 1 min。公式中除以 t 是为了明确单位定义（每分钟）。
        简化公式（比色杯 d=1 cm）：
        GPX 活性 (U/mL) = (ΔA_corrected / min × V_t × DF) / (6.22 × V_s)

  4. 标准化（比活性）： 为了比较不同样品间的差异，通常需要将酶活性标准化为每毫克蛋白质的活性（比活性）。
    比活性 (U/mg prot) = GPX 活性 (U/mL) / 样品蛋白浓度 (mg prot/mL)

 

六、 注意事项

  1. 样品制备： 保持低温操作，避免反复冻融，尽快测定。彻底匀浆/裂解并去除不溶物是关键。准确测定蛋白浓度用于标准化。
  2. 试剂稳定性： NADPH 溶液对光敏感，需避光保存并现用现配（或分装冻存于-80°C）。GSH 溶液也易氧化，建议临用前配制或分装冻存。GR 需按说明书保存和使用。
  3. 底物选择与浓度： 选择合适的底物（t-BOOH 通用性较好，稳定性高；H₂O₂ 对某些GPX同工酶更特异但易分解）。底物浓度需优化，过低则反应慢，过高可能导致底物抑制或非酶促反应。
  4. 线性范围： 确保反应速率在线性范围内（ΔA₃₄₀/min 恒定）。样品加入量或酶活性过高会导致曲线过早偏离线性。需要通过预实验确定合适的样品稀释度或加入量。
  5. 温度控制： 反应温度（25°C 或 37°C）需精确控制并保持恒定，温度波动显著影响酶活性和反应速率。
  6. 混匀： 加入底物启动反应后需迅速彻底混匀，避免局部浓度不均影响结果准确性。
  7. 仪器校正： 确保分光光度计或酶标仪波长准确，比色杯洁净无划痕。使用酶标板时注意光程校正。
  8. 对照设置： 严格设置样品空白和试剂空白，准确扣除非酶促反应的影响。
  9. 安全： 叔丁基过氧化氢和叠氮钠为有毒化学品，操作时需佩戴防护用具，在通风橱内配制，并按规范处置废液。
 

七、 总结

谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）活性的准确检测是评估生物体抗氧化能力的重要指标。基于谷胱甘肽还原酶（GR）偶联的 NADPH 消耗法因其灵敏度高、特异性好、操作相对简便而被广泛采用。该方法的核心在于监测 GPX 催化反应所间接导致的 NADPH 在 340 nm 处吸光度的下降速率。要获得可靠的结果，关键在于：1) 样品的合理制备与处理；2) 试剂的新鲜配制与准确添加；3) 反应条件（温度、时间）的严格控制；4) 反应在线性范围内的监测；5) 合理设置空白对照；6) 使用准确的摩尔消光系数和光程值进行计算；7) 最终活性数据用蛋白浓度进行标准化。严格遵循操作规程和注意事项，可获得反映真实生物学意义的 GPX 活性数据，为相关研究提供重要依据。