谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活性检测方法详解
一、 引言
谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione Peroxidase, GPX, EC 1.11.1.9)是一类重要的含硒(部分同工酶不含硒)抗氧化酶,在生物体的抗氧化防御系统中扮演核心角色。其主要功能是催化还原型谷胱甘肽(GSH)还原脂质氢过氧化物(LOOH)和过氧化氢(H₂O₂),生成氧化型谷胱甘肽(GSSG)和相应的醇或水。该过程有效清除有害的活性氧(ROS),保护细胞膜、蛋白质和核酸免受氧化损伤。准确测定GPX活性对于评估生物体的氧化应激水平、研究抗氧化剂功效、探究疾病(如神经退行性疾病、心血管疾病、癌症等)的氧化损伤机制以及环境毒理学研究等至关重要。
二、 检测原理(NADPH 偶联法)
目前最常用且可靠的GPX活性检测方法是基于谷胱甘肽还原酶(Glutathione Reductase, GR)偶联的NADPH消耗法。其核心原理如下:
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GPX 催化反应: GPX 催化底物(通常为叔丁基过氧化氢或H₂O₂)被还原型谷胱甘肽(GSH)还原,同时生成氧化型谷胱甘肽(GSSG)和水或醇。
ROOH + 2GSH → GSSG + ROH + H₂O
(ROOH 代表有机氢过氧化物或 H₂O₂) -
GR 偶联反应: 反应生成的 GSSG 在谷胱甘肽还原酶(GR)的作用下,利用还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)作为还原当量供体,被还原回两分子的 GSH。此过程伴随 NADPH 被氧化成 NADP⁺。
GSSG + NADPH + H⁺ → 2GSH + NADP⁺
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NADPH 消耗监测: NADPH 在 340 nm 波长处具有特征性吸收峰。随着偶联反应的进行,NADPH 不断被消耗,导致反应体系中 340 nm 处的吸光度(A₃₄₀)随时间下降。NADPH 消耗的速率与 GPX 催化反应的速率成正比。
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活性计算: 因此,通过连续监测反应体系在 340 nm 处吸光度下降的速率(ΔA₃₄₀ / min),即可推算出 GPX 的酶活性。单位时间内吸光度下降得越快,表明 GPX 活性越高。
三、 所需试剂与材料
- 缓冲液: 适合GPX活性的反应缓冲液(如磷酸盐缓冲液 PBS, 50-100 mM, pH 7.0-7.8),通常含 EDTA(~1 mM)以螯合金属离子。
- 谷胱甘肽还原酶(GR): 纯化的谷胱甘肽还原酶。
- 还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH): 还原型辅酶。
- 还原型谷胱甘肽(GSH): 底物之一。
- 底物(过氧化物): 常用叔丁基过氧化氢(t-BOOH, 如 30-50 mM 储备液)或过氧化氢(H₂O₂, 如 50-100 mM 储备液)。选择需考虑GPX同工酶特异性及稳定性(H₂O₂易分解)。
- 叠氮钠(NaN₃): (可选,~1 mM)用于抑制样品中可能存在的过氧化氢酶活性(若使用H₂O₂作底物)。
- 待测样品: 组织匀浆上清液、细胞裂解液、血清/血浆、或纯化酶液。样品需适当制备(如匀浆、离心去除碎片、测定蛋白浓度)。
- 蛋白浓度测定试剂: (如 Bradford 法试剂)用于标准化酶活性。
- 蒸馏水或去离子水: 配制所有溶液。
四、 实验步骤(示例)
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样品制备:
- 组织样本:精确称取组织,加入适量预冷的匀浆缓冲液(如 PBS),冰浴下充分匀浆。离心(如 10,000-15,000 × g, 4°C, 15-30 min),取上清液作为待测样品。
- 细胞样本:收集细胞,PBS洗涤,加入适量裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂),冰上裂解。离心(如 10,000 × g, 4°C, 10 min),取上清液。
- 血清/血浆:可直接使用或适当稀释。
- 测定所有待测样品的蛋白质浓度(如 Bradford 法)。
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反应体系配制(以 1 ml 反应体系为例,体积可等比例缩放):
- 在比色杯(光程 1 cm)或微孔板孔中加入:
- 缓冲液:补充至终体积。
- GSH:终浓度 1-5 mM。
- GR:适量活性单位(通常按试剂说明或预实验确定,确保反应速率由GPX决定)。
- NADPH:终浓度约 0.15-0.25 mM(吸光度起始值在 0.8-1.0 AU 左右为宜)。
- 叠氮钠:(若使用H₂O₂)终浓度约 1 mM。
- 待测样品:适量体积(通常使反应速率在线性范围内,预实验确定)。空白管用缓冲液或样品稀释液代替样品。
- 轻轻混匀,置于设定为 25°C 或 37°C 的分光光度计或酶标仪样品室中,预温育 3-5 分钟。
- 在比色杯(光程 1 cm)或微孔板孔中加入:
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启动反应与监测:
- 加入预温的底物(t-BOOH 或 H₂O₂)启动反应。终浓度通常为:
- t-BOOH: 0.5-1.5 mM
- H₂O₂: 0.1-0.5 mM (浓度过高可能抑制酶活或产生非酶促反应)。
- 立即开始计时,在 340 nm 波长下,连续监测吸光度(A₃₄₀)的变化至少 3-5 分钟(通常每分钟记录一次读数),确保反应速率在线性下降阶段(ΔA₃₄₀/min 恒定)。
- 加入预温的底物(t-BOOH 或 H₂O₂)启动反应。终浓度通常为:
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空白对照: 同时设置两种空白对照:
- 样品空白(非酶促对照): 不含底物(t-BOOH/H₂O₂)的反应体系(加样品),用于校正样品本身可能的 NADPH 消耗。
- 试剂空白: 不含样品(用缓冲液代替)和底物的反应体系,用于校正 NADPH 的非酶降解或光漂白(通常变化极小)。
五、 数据处理与活性计算
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计算吸光度变化速率:
- 使用监测数据,以时间(min)为横坐标,A₃₄₀ 为纵坐标作图。
- 选取线性下降阶段(通常是最初的 1-3 分钟),计算其斜率(ΔA₃₄₀ / min)。
- 对于样品管(含底物):斜率 = ΔA_sample / min
- 对于样品空白管(不含底物):斜率 = ΔA_sample_blank / min
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计算校正后的酶促反应速率:
ΔA_corrected / min = | (ΔA_sample / min) - (ΔA_sample_blank / min) |
(取绝对值,因为速率是下降的) -
计算酶活性单位:
GPX 活性通常定义为:在特定反应条件下(温度、pH),每分钟催化消耗 1 μmol NADPH 所需的酶量。- 摩尔消光系数(ε): NADPH 在 340 nm 处的摩尔消光系数为 6.22 × 10³ L mol⁻¹ cm⁻¹ (适用于光程 1 cm 的比色杯)。对于微孔板,需根据实际光程校正或使用厂家提供的校正值。
- 活性计算公式:
GPX 活性 (U/mL) = [ (ΔA_corrected / min) × V_t × DF ] / (ε × d × V_s × t)
ΔA_corrected / min
:校正后的每分钟吸光度变化值。V_t
:反应体系总体积(单位:mL,如 1 mL)。DF
:样品在反应体系中的稀释倍数(例如,若反应体系中样品体积是0.1 mL,样品原始浓度为10 mg蛋白/mL,则 DF = V_t / V_s = 1 / 0.1 = 10,但通常指样品在反应前被稀释的倍数)。ε
:NADPH 在 340 nm 的摩尔消光系数(6.22 × 10³ L mol⁻¹ cm⁻¹ = 6.22 × 10³ mL μmol⁻¹ cm⁻¹,因为 1 L = 1000 mL, 1 mol = 10⁶ μmol)。d
:比色杯光程(单位:cm,标准比色杯为 1 cm;酶标板需查实际光程)。V_s
:反应体系中加入的样品体积(单位:mL)。t
:时间单位(min),因为 ΔA/min 已经包含每分钟,所以此处 t = 1 min。公式中除以 t 是为了明确单位定义(每分钟)。
简化公式(比色杯 d=1 cm):GPX 活性 (U/mL) = (ΔA_corrected / min × V_t × DF) / (6.22 × V_s)
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标准化(比活性): 为了比较不同样品间的差异,通常需要将酶活性标准化为每毫克蛋白质的活性(比活性)。
比活性 (U/mg prot) = GPX 活性 (U/mL) / 样品蛋白浓度 (mg prot/mL)
六、 注意事项
- 样品制备: 保持低温操作,避免反复冻融,尽快测定。彻底匀浆/裂解并去除不溶物是关键。准确测定蛋白浓度用于标准化。
- 试剂稳定性: NADPH 溶液对光敏感,需避光保存并现用现配(或分装冻存于-80°C)。GSH 溶液也易氧化,建议临用前配制或分装冻存。GR 需按说明书保存和使用。
- 底物选择与浓度: 选择合适的底物(t-BOOH 通用性较好,稳定性高;H₂O₂ 对某些GPX同工酶更特异但易分解)。底物浓度需优化,过低则反应慢,过高可能导致底物抑制或非酶促反应。
- 线性范围: 确保反应速率在线性范围内(ΔA₃₄₀/min 恒定)。样品加入量或酶活性过高会导致曲线过早偏离线性。需要通过预实验确定合适的样品稀释度或加入量。
- 温度控制: 反应温度(25°C 或 37°C)需精确控制并保持恒定,温度波动显著影响酶活性和反应速率。
- 混匀: 加入底物启动反应后需迅速彻底混匀,避免局部浓度不均影响结果准确性。
- 仪器校正: 确保分光光度计或酶标仪波长准确,比色杯洁净无划痕。使用酶标板时注意光程校正。
- 对照设置: 严格设置样品空白和试剂空白,准确扣除非酶促反应的影响。
- 安全: 叔丁基过氧化氢和叠氮钠为有毒化学品,操作时需佩戴防护用具,在通风橱内配制,并按规范处置废液。
七、 总结
谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活性的准确检测是评估生物体抗氧化能力的重要指标。基于谷胱甘肽还原酶(GR)偶联的 NADPH 消耗法因其灵敏度高、特异性好、操作相对简便而被广泛采用。该方法的核心在于监测 GPX 催化反应所间接导致的 NADPH 在 340 nm 处吸光度的下降速率。要获得可靠的结果,关键在于:1) 样品的合理制备与处理;2) 试剂的新鲜配制与准确添加;3) 反应条件(温度、时间)的严格控制;4) 反应在线性范围内的监测;5) 合理设置空白对照;6) 使用准确的摩尔消光系数和光程值进行计算;7) 最终活性数据用蛋白浓度进行标准化。严格遵循操作规程和注意事项,可获得反映真实生物学意义的 GPX 活性数据,为相关研究提供重要依据。