谷胱甘肽S-转移酶(GST)活性检测

谷胱甘肽S-转移酶(GST)活性检测方法

一、 引言
谷胱甘肽S-转移酶(GST, EC 2.5.1.18)是一类广泛存在于生物体内的Ⅱ相代谢酶超家族。其主要生理功能是催化还原型谷胱甘肽(GSH)的巯基(-SH)与多种亲电子性内源或外源有害物质的结合反应，形成水溶性更高的谷胱甘肽结合物，从而促进这些物质的解毒与排泄。GST活性水平是评估生物体解毒能力、抗氧化应激状态以及研究环境污染物毒性效应、药物代谢和疾病（如癌症、神经退行性疾病）发生发展的重要生物标志物。准确测定GST活性对于基础研究和应用领域具有重要意义。

二、 检测原理（基于CDNB底物的分光光度法）
本方法采用最经典、应用最广泛的1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)作为人工底物，利用分光光度法检测GST活性。其反应原理如下：

1. 酶促反应：

2. 检测基础：
   • 反应产物GS-DNB在特定波长（通常在340 nm附近）具有特征性光吸收。
   • 底物CDNB和GSH在此波长处的背景吸收相对较低。
   • 随着反应的进行，GS-DNB的生成量增加，其在340 nm处的吸光度值(A340)随时间呈线性上升。
   • 通过监测单位时间内A340的增加值(ΔA340/min)，即可计算出GST催化反应的速率，从而反映酶活性大小。

三、 主要试剂与材料

• 缓冲液 (0.1 M磷酸钾缓冲液, pH 6.5): 准确称取磷酸二氢钾和磷酸氢二钾，用符合GB/T 6682标准的一级去离子水溶解并定容，使用精密pH计调节pH至6.5±0.01。
• 还原型谷胱甘肽(GSH)溶液 (30 mM): 准确称取GSH粉末，溶解于冰冷的0.1 M磷酸钾缓冲液(pH 6.5)中，临用前配制。避光保存于冰上。
• 1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)溶液 (30 mM): 准确称取CDNB粉末，溶解于高效液相色谱级无水乙醇中。避光保存于棕色瓶，4℃储存备用（注意：CDNB具刺激性，操作时需佩戴手套并在通风橱中进行）。
• 待测酶样品： 组织匀浆上清液、细胞裂解液、血清、纯化酶液等。样品需置于冰上保持低温。建议预先测定样品蛋白浓度（如采用BCA法或Bradford法）。
• 对照试剂： 不含酶的缓冲液（作为试剂空白）、灭活酶样品（如沸水浴处理5分钟，作为样品背景对照）。
• 主要仪器设备：
  • 紫外/可见分光光度计（带恒温比色皿架）
  • 恒温水浴锅
  • 精密移液器及配套吸头
  • 石英或玻璃比色皿（光径1 cm）
  • 计时器
  • 冰盒
  • 离心机（用于样品制备）

四、 操作步骤 (以1 mL反应体系为例)

1. 预热： 将分光光度计恒温比色皿架温度设置为25℃（或37℃，需在报告中注明），预热至少15分钟。将缓冲液、GSH溶液、CDNB溶液置于25℃（或37℃）水浴中平衡至少10分钟。
2. 准备反应混合液： 在预冷的微量离心管中，依次加入：
   • 0.1 M磷酸钾缓冲液(pH 6.5)： 880 μL
   • 30 mM GSH溶液： 50 μL (终浓度 1.5 mM)
   • 待测酶样品 (或对照)： X μL (通常加入10-50 μL，确保ΔA340/min在0.01-0.05之间线性范围内)
   • 用缓冲液补足至： 950 μL
3. 混匀与预热： 轻轻混匀反应混合液，转移至预热好的比色皿中，放入分光光度计样品室（已恒温），平衡1-2分钟。
4. 启动反应与监测：
   • 设置分光光度计在340 nm波长处。
   • 读取并记录基线吸光度（通常持续10-30秒确认稳定）。
   • 迅速加入： 50 μL 预热的30 mM CDNB溶液（终浓度 1.5 mM）至比色皿中。
   • 立即混匀： 快速上下抽吸混合数次（避免产生气泡）。
   • 开始计时： 立即启动计时器。
   • 连续监测： 在340 nm波长下连续记录吸光度变化(A340)，持续监测2-5分钟（或直至观察到明显的线性变化区间）。
5. 对照实验： 同时进行试剂空白（用等体积缓冲液代替酶样品）和样品背景对照（用灭活酶样品代替活性酶样品）实验，操作步骤同上。

五、 数据处理与计算

1. 确定反应速率：

   • 将记录的A340对时间(t, min)作图。
   • 选取反应起始线性阶段（通常是最初1-3分钟），计算该区间内每分钟吸光度的变化值(ΔA340/min)。应扣除试剂空白和/或样品背景对照的速率（若有显著背景）。
   • 计算公式：
     ΔA340/min = (A_t2 - A_t1) / (t2 - t1)
     其中 A_t2 和 A_t1 分别是时间点 t2 和 t1 (单位：min) 的吸光度值。

2. 计算GST活性：

   • 摩尔消光系数(ε)： GS-DNB在340 nm处的摩尔消光系数通常取 9.6 mM⁻¹ cm⁻¹ (在25℃, pH 6.5条件下测定值。若温度或波长有调整，需查阅文献使用对应值)。
   • 酶活性单位定义： 一个国际单位(U)的GST活性定义为：在特定反应条件下（温度、pH），每分钟催化生成1 μmol GS-DNB产物所需的酶量。
   • 活性计算公式：
     GST活性 (U/mL样品) = (ΔA340/min * V_t * D) / (ε * L * V_e)
GST活性 (U/mg蛋白) = [GST活性 (U/mL样品)] / [样品蛋白浓度 (mg蛋白/mL样品)]
     • ΔA340/min： 校正后的每分钟吸光度变化值（通常已扣除空白）。
     • V_t： 反应体系总体积 (mL)。本例中为 1.0 mL。
     • D： 样品稀释倍数（如果样品在加入反应体系前经过稀释）。
     • ε： GS-DNB在340 nm处的摩尔消光系数 (9.6 mM⁻¹ cm⁻¹ 或 9600 L mol⁻¹ cm⁻¹)。
     • L： 比色皿光径 (cm)。通常为1 cm。
     • V_e： 反应体系中加入的酶样品体积 (mL)。

简化公式示例 (当 V_t = 1 mL, L = 1 cm, ε = 9.6 mM⁻¹ cm⁻¹)：
GST活性 (U/mL样品) = (ΔA340/min * 1.0) / (9.6 * 1) ≈ (ΔA340/min) / 9.6
GST活性 (U/mg蛋白) = [(ΔA340/min) / 9.6] / [蛋白浓度 (mg/mL)]

六、 关键注意事项

1. 温度控制： 温度对酶促反应速率影响显著，必须严格控制反应温度（通常为25℃或37℃）并保持恒定。缓冲液、底物溶液和样品均需提前平衡至反应温度。
2. 底物稳定性与浓度：
   • CDNB溶液在乙醇中相对稳定（4℃避光），但GSH水溶液不稳定，极易氧化，必须临用前配制并置于冰上避光。
   • 推荐底物终浓度：GSH 1.0-2.0 mM， CDNB 1.0-2.0 mM。过高浓度可能导致底物抑制或偏离线性。需根据具体样品优化。
3. 酶量选择： 加入的酶量应使ΔA340/min落在0.01-0.05的线性范围内。过高会导致反应过快，非线性；过低则信号弱，误差大。需通过预实验确定最佳样品加入量或稀释倍数。
4. 反应启动与混匀： CDNB加入后必须立即充分混匀且开始计时，这是获得准确初始速率的关键步骤。
5. 背景扣除： 必须设置试剂空白（所有试剂，无酶）和样品背景对照（灭活酶样品）。样品本身在340 nm可能有吸光物质，CDNB的非酶促反应（与GSH）也可能产生少量背景信号，需校正。
6. 样品处理： 组织或细胞样品需在冰冷缓冲液中快速匀浆/裂解，离心取上清。制备过程保持低温，防止酶失活。血清等液体样品可直接稀释使用。测定前需测定样品蛋白浓度。
7. 干扰物质： 样品中高浓度的还原剂（如DTT）、螯合剂、有机溶剂可能干扰反应或影响酶活性，需评估其影响或尽量移除。
8. 标准曲线与质控： 对于精确测定，可考虑使用纯化的GST标准品制作标准曲线。每次实验可加入已知活性的质控样品以评估方法可靠性。
9. 安全： CDNB有毒且有刺激性，配制和使用时需穿戴实验服、手套和护目镜，并在通风橱内操作。废液按有害化学品妥善处理。

七、 方法学评价与意义

CDNB法测定GST活性具有原理清晰、操作简便、灵敏度较高、成本低廉、重现性好等优点，是实验室最常用的标准方法。它能够灵敏地反映样品中GST的总体催化活性（尤其是对亲电子底物的结合能力）。该方法已被广泛应用于：

• 环境毒理学： 评估污染物（农药、重金属等）对水生生物、陆生生物的胁迫效应及解毒能力变化。
• 药理学与毒理学： 研究药物代谢、药物相互作用、肝脏解毒功能及化学毒物的生物转化。
• 临床医学： 探讨GST在肿瘤（耐药性、预后标志物）、氧化应激相关疾病（神经退行性疾病、心血管疾病、糖尿病并发症）中的作用及其作为生物标志物的价值。
• 基础生物化学： 酶学性质研究（动力学、抑制剂筛选）、基因工程表达产物的活性鉴定与纯化追踪。

通过标准化操作和严格的质量控制，该方法可为相关研究提供可靠的GST活性数据。

注意： 实际实验参数（如反应温度、底物终浓度、样品体积、检测波长、摩尔消光系数值）应根据具体实验条件和所参考的权威文献或标准操作规程进行调整并在报告中明确说明。使用前务必查阅最新文献确认相关参数。