谷胱甘肽还原酶(GR)活性检测

发布时间：2025-06-28 08:01:39 阅读量：2 作者：生物检测中心

谷胱甘肽还原酶(GR)活性检测：原理、流程与应用

一、 引言

谷胱甘肽还原酶（Glutathione Reductase, GR; EC 1.8.1.7）是细胞内维持氧化还原稳态的关键酶之一，存在于胞浆和线粒体中。它的主要生理功能是催化氧化型谷胱甘肽（GSSG）还原为还原型谷胱甘肽（GSH），同时消耗还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）。GSH是细胞内最重要的非蛋白巯基化合物和抗氧化剂，在清除活性氧自由基（ROS）、维持蛋白质巯基还原状态、解毒外源性物质等方面发挥核心作用。因此，GR活性的检测对于评估细胞的抗氧化能力、研究氧化应激相关疾病（如神经退行性疾病、心血管疾病、糖尿病、衰老、癌症等）以及药物或环境毒素的氧化损伤机制至关重要。

二、 检测原理

GR活性检测最常用、最经典的方法是分光光度法，其原理基于酶促反应过程中NADPH在340 nm波长处吸光度（A340）的动态变化。

  • 核心反应：
    GSSG + NADPH + H⁺ → 2GSH + NADP⁺
  • 检测依据： NADPH在340 nm处有特征性吸收峰，而氧化产物NADP⁺在此波长下几乎无吸收。因此，GR催化上述反应时，NADPH被消耗，导致反应体系在340 nm处的吸光度（A340）随时间下降。
  • 活性计算： GR活性单位定义为：在特定条件下（通常为37°C，pH 7.0-7.5），每分钟消耗1 μmol NADPH所需的酶量（即1个国际单位，U）。通过监测反应起始后一段时间内（通常是1-3分钟）A340的下降速率（ΔA/min），结合NADPH的摩尔消光系数（ε）和反应体系相关信息，即可计算出GR的活性。
 

三、 实验材料与试剂（通用名称）

  1. 缓冲液： 磷酸盐缓冲液（如0.1 M磷酸钾缓冲液，pH 7.5），含EDTA（如1 mM）以整合可能抑制酶活的金属离子。
  2. 底物溶液：
    • 氧化型谷胱甘肽（GSSG）溶液： 用缓冲液配制（如终浓度约2-4 mM）。
    • 还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）溶液： 用缓冲液新鲜配制（如终浓度约0.1-0.2 mM）。NADPH对光敏感且在水溶液中不稳定，需临用前配制并避光保存于冰上。
  3. 待测样品： 根据研究目的制备。
    • 组织匀浆： 取组织样品（如肝脏、脑、肾脏等），按重量体积比（如1:9或1:10）加入冰冷的提取缓冲液（常为磷酸盐缓冲液，含EDTA），冰浴条件下充分匀浆。匀浆液需在低温（4°C）下高速离心（如10, 000 - 15, 000 g，15-30分钟），取上清液作为待测酶液。离心条件和缓冲液成分可根据组织类型优化。
    • 细胞裂解物： 收集细胞，用冰冷的裂解缓冲液（如含Triton X-100或NP-40及蛋白酶抑制剂的磷酸盐缓冲液）裂解细胞。裂解液低温离心，取上清液。
    • 血清/血浆： 采集血液后，按标准方法分离血清或血浆（注意抗凝剂选择），可直接或适当稀释后测定。
  4. 其他：
    • 双蒸水或去离子水。
    • 移液器及相应吸头。
    • 比色皿（光径通常为1 cm）。
    • 恒温装置（水浴锅或恒温比色皿架）。
    • 分光光度计（需有恒温控制功能，可在340 nm处准确读数并记录动力学变化）。
 

四、 实验操作步骤（示例：组织匀浆液检测）

以下步骤以终体积1 mL反应体系为例，具体体积和浓度可根据仪器和试剂进行调整。

  1. 预热： 将分光光度计恒温舱或水浴锅温度设定至37°C。预热缓冲液、GSSG溶液和NADPH溶液（NADPH溶液预热时间不宜过长）。
  2. 空白管设置（用于调零）：
    • 取一个比色皿，加入：
      • 缓冲液： 约980 μL (体积根据实际体系调整，需补足至终体积)
      • NADPH溶液： 20 μL (使终浓度达到目标值，如0.1 mM)
    • 混匀，放入37°C恒温比色皿架中，孵育3-5分钟以达到热平衡。
    • 设定分光光度计波长340 nm，用此混合液调零（或作为空白对照）。
  3. 测定管设置：
    • 取另一个比色皿，加入：
      • 缓冲液： 约870 μL (体积需根据样品体积调整，补足至终体积)
      • GSSG溶液： 100 μL (使终浓度达到目标值，如2 mM)
      • 待测样品（组织匀浆上清液）：适量（如10-50 μL，根据预实验结果确定，使反应初速率在线性范围内）。用缓冲液补足体积至980 μL。
    • 混匀，放入37°C恒温比色皿架中，孵育3-5分钟以达到热平衡。
    • 加入NADPH溶液：20 μL (使终浓度达到目标值，如0.1 mM)。立即轻柔而快速地混匀。
  4. 动力学监测：
    • 迅速将比色皿放入已调零的光路中。
    • 立即开始记录反应体系在340 nm处的吸光度（A340）随时间的变化，持续监测至少1-3分钟（或直至观察到稳定的线性下降）。仪器应设置为动力学模式，记录时间间隔（如每15-30秒记录一次数据）。
  5. 计算ΔA/min： 从记录的A340数据中，选择反应初期的线性下降阶段（通常是最初的60-90秒），计算每分钟的平均吸光度下降值（ΔA/min）。斜率应为负值（A340下降）。
 

五、 活性计算

GR活性通常表示为每毫克蛋白所含的酶活性单位（U/mg prot）或每毫升样品（如血清）所含的酶活性单位（U/mL）。

计算公式：

GR活性 = (ΔA/min * Vt * DF) / (ε * d * Vs * P)

  • ΔA/min： 反应体系中A340每分钟的平均下降值（从线性部分计算得出）。
  • Vt： 反应体系的总体积（单位：mL，示例中为1 mL）。
  • DF： 样品的稀释倍数（例如，匀浆时1g组织加9mL缓冲液，则DF=10；若上清液在反应中又被稀释，则总DF需相乘）。
  • ε： NADPH在340 nm处的摩尔消光系数（6.22 mM⁻¹ cm⁻¹ 或 6220 M⁻¹ cm⁻¹）。
  • d： 比色皿光径（单位：cm，通常为1 cm）。
  • Vs： 加入到反应体系中的样品体积（单位：mL，示例中可能是0.01或0.05 mL）。
  • P： 样品中的蛋白浓度（单位：mg/mL）。仅当计算比活性(U/mg prot)时需要。需用标准方法（如Bradford法、BCA法）预先测定样品蛋白浓度。若计算U/mL样品（如血清），则此项去掉。
  • 单位换算：
    • 公式计算结果单位为 μmol NADPH/min / mL样品（或 / mg prot）。
    • 由于1个酶活性单位(U) = 1 μmol NADPH/min，因此计算结果数值可直接表示为 U/mL样品 或 U/mg prot。
 

示例计算（假设）：

  • ΔA/min = -0.15 min⁻¹ (取正值0.15用于计算)
  • Vt = 1.0 mL
  • DF = 10 (匀浆时1:9)
  • ε = 6.22 mM⁻¹ cm⁻¹ = 6.22 * 10³ M⁻¹ cm⁻¹ = 6220 L mol⁻¹ cm⁻¹
  • d = 1 cm
  • Vs = 0.05 mL (加入反应体系的样品体积)
  • P = 20 mg/mL (样品蛋白浓度)
 

GR活性 (U/mg prot) = (0.15 min⁻¹ * 1.0 mL * 10) / (6220 L mol⁻¹ cm⁻¹ * 1 cm * 0.05 mL * 20 mg/mL)

  1. 分子： 0.15 * 1.0 * 10 = 1.5
  2. 分母：(6220) * (1) * (0.05) * (20) = 6220 * 0.05 = 311, 311 * 20 = 6220
  3. 活性 = 1.5 / 6220 ≈ 0.000241 U/mg prot 或 0.241 mU/mg prot
    • (注：实际值可能更大，此计算仅为演示公式应用)
 

六、 注意事项与质量控制

  1. 样品新鲜度： GR相对稳定，但仍建议使用新鲜制备的样品或在-80°C妥善保存的样品（避免反复冻融）。
  2. 试剂稳定性： NADPH溶液不稳定，易氧化分解，必须新鲜配制，避光、冰上保存，尽快使用。GSSG溶液可在-20°C分装保存较长时间。
  3. 温度控制： 精确的温度控制（37°C）对酶活性测定至关重要。确保比色皿在读数前充分预热。
  4. 反应线性： NADPH的消耗速率（ΔA/min）必须在所选时间段内呈线性。待测样品体积需优化，使ΔA/min在0.01-0.20 /min范围内较为理想（避免过快或过慢）。
  5. 混合操作： 加入NADPH启动反应后，必须迅速且充分混匀（避免剧烈震荡产生气泡），并立即放入光路开始读数，以减少延迟误差。
  6. 空白对照： 除试剂空白（调零用）外，有时需设置样品空白（即反应体系中不加NADPH，或加入灭活的样品），以扣除样品自身在340 nm处的背景吸收或可能存在的干扰反应。
  7. 双管平行： 每个样品应至少做双管平行测定，取平均值，以保证结果的可靠性。
  8. 质量控制： 定期使用已知活性的标准品或质控样本进行检测，监控方法的准确性和精密度。
  9. 干扰因素： 高浓度血红蛋白（溶血样本）或其他在340 nm附近有吸收的物质可能干扰结果。严重溶血样本不宜用于测定。某些药物或化合物也可能影响GR活性或干扰测定。
  10. pH值： 确保所有溶液pH准确，缓冲能力足够维持反应过程中pH稳定（通常pH 7.0-7.5是GR最适范围）。
 

七、 应用与意义

GR活性检测广泛应用于多个领域：

  1. 基础研究：
    • 研究细胞氧化还原状态调控机制。
    • 探索氧化应激在生理和病理过程中的作用（老化、凋亡、信号转导等）。
    • 评价基因敲除/过表达模型中抗氧化酶系统的改变。
  2. 临床医学：
    • 疾病诊断与风险评估： 作为氧化应激生物标志物，评估在心血管疾病（动脉粥样硬化、心衰）、神经退行性疾病（阿尔茨海默病、帕金森病）、糖尿病及其并发症、肝肾疾病、慢性炎症性疾病、某些癌症、某些遗传性疾病（如G6PD缺乏症可能间接影响GR底物NADPH供应）患者中的水平变化。
    • 疗效监测： 评估抗氧化治疗（如药物、膳食补充剂）的效果。
    • 环境与职业医学： 评估重金属、农药、有机溶剂等环境毒素暴露引起的氧化损伤。
  3. 药物研发与毒理学： 筛选具有抗氧化或诱导抗氧化酶活性的候选药物；评价药物或化合物的潜在氧化毒性。
 

八、 总结

谷胱甘肽还原酶（GR）是维持细胞内谷胱甘肽还原态和整体抗氧化防御能力的关键酶。基于NADPH在340 nm吸光度下降的分光光度法，是测定GR活性最常用、可靠的方法。通过严格控制实验条件（温度、pH、试剂新鲜度）、优化样品用量、确保反应线性并进行严格的质量控制，可以获得准确可靠的GR活性数据。该检测在揭示氧化应激机制、疾病诊断与风险评估、药物研发及环境健康评价等方面具有重要的理论和应用价值。

参考文献： (建议查阅以下经典文献或最新方法学综述)

  1. Carlberg, I., & Mannervik, B. (1975). Purification and characterization of the flavoenzyme glutathione reductase from rat liver. Journal of Biological Chemistry, 250(14), 5475-5480. (经典方法参考)
  2. Griffith, O. W. (1980). Determination of glutathione and glutathione disulfide using glutathione reductase and 2-vinylpyridine. Analytical Biochemistry, 106(1), 207-212. (涉及GR在GSH/GSSG测定中的应用，GR活性测定原理相同)。
  3. Anderson, M. E. (1985). Glutathione reductase. Methods in Enzymology, 113, 548-555. (经典酶学方法卷中的详细方案)。
  4. Rahman, I., Kode, A., & Biswas, S. K. (2006). Assay for quantitative determination of glutathione and glutathione disulfide levels using enzymatic recycling method. Nature Protocols, 1(6), 3159-3165. (包含GR活性检测的标准步骤)。
 

请注意：具体实验操作中的最佳反应体积、底物浓度、样品稀释倍数等参数，需根据所使用的分光光度计型号、比色皿规格、样品类型（组织、细胞、血清）以及待测酶活性的预期范围进行预实验优化调整。