氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量检测

发布时间：2025-06-28 08:01:39 阅读量：1 作者：生物检测中心

GSSG含量检测：原理、方法与应用

谷胱甘肽（Glutathione）是细胞内最重要的小分子硫醇抗氧化剂之一，主要存在还原型（GSH）和氧化型（GSSG）两种形式。GSSG含量及其与总谷胱甘肽（GSH + GSSG）的比值（GSSG/GST）是评估细胞内氧化应激状态的敏感生物标志物。准确检测GSSG含量对于研究氧化还原稳态、疾病机制、药物毒理及营养干预等至关重要。

一、 GSSG的生化意义

  • 氧化还原稳态指示器： 正常情况下，细胞GSH/GSSG比值很高（>100:1），维持强还原环境。氧化应激（如活性氧/氮物种ROS/RNS增加）会消耗GSH生成GSSG，导致GSSG积累和GSH/GSSG比值下降。
  • 硫醇-二硫化物交换调节： GSSG参与蛋白质硫醇-二硫键交换反应，影响蛋白质结构和功能。
  • 信号转导： 谷胱甘肽氧化还原状态的变化参与调控多种信号通路（如NF-κB、AP-1）。
 

二、 GSSG含量检测原理与常用方法

检测GSSG的核心挑战在于：

  1. 细胞内GSSG含量远低于GSH（通常<1%总谷胱甘肽）。
  2. 样品处理过程中GSH极易自发氧化成GSSG，导致假阳性。
  3. 需要特异性区分GSH和GSSG。
 

常用策略是：

  1. 阻断GSH氧化： 使用烷化剂（如N-乙基马来酰亚胺 - NEM）快速、不可逆地与样品中的GSH结合，阻止其氧化为GSSG。
  2. 特异性测定GSSG： 测定经烷化处理的样品中的GSSG含量。
  3. 间接计算或直接测定GSH： 测定总谷胱甘肽（GST = GSH + 2GSSG）含量，然后计算GSH（GSH = GST - 2GSSG），或者使用特异性方法测定未经烷化样品中的GSH。
 

主流检测方法：

  1. 酶循环法 (基于谷胱甘肽还原酶 - GR)：

    • 原理： 是目前最常用、灵敏且相对特异的GSSG检测方法。
    • 步骤：
      • 样品快速预处理与烷化： 样品（组织匀浆液、细胞裂解液、血浆/血清等）采集后立即加入含有酸性试剂（如偏磷酸、磺基水杨酸）和NEM的溶液进行去蛋白化和烷化GSH。冰上孵育使NEM充分反应（通常5-15分钟）。随后中和或稀释样品以进行后续酶反应。
      • 酶促反应：
        • 在含有NADPH（还原型辅酶Ⅱ）和谷胱甘肽还原酶（GR）的反应体系中，加入处理好的样品。
        • GR催化反应：GSSG + NADPH + H⁺ → 2GSH + NADP⁺
        • NADPH的消耗速率与样品中GSSG浓度成正比（340nm处吸光度下降速率ΔA/min）。
      • 测定： 在分光光度计340nm处监测吸光度随时间的变化。
      • 计算： 根据标准曲线（已知浓度GSSG标准品）计算样品GSSG浓度。
    • 优点： 灵敏度高、特异性好（只检测GSSG底物）、线性范围宽、步骤标准化程度高。
    • 关键注意事项： NEM浓度和反应时间必须优化以确保完全烷化GSH且不过量（过量NEM可能抑制GR活性）；中和步骤要彻底，避免酸性环境抑制酶活；NADPH稳定性需保证。

  2. DTNB（Ellman试剂）衍生化法：

    • 原理： DTNB（5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)）与硫醇基团（-SH）反应生成黄色的2-硝基-5-硫代苯甲酸阴离子（TNB⁻），在412nm处有强吸收。
    • 步骤：
      • 样品经酸性去蛋白化后，必须先用NEM烷化所有GSH（防止其干扰GSSG测定）。
      • 还原步骤： 在烷化后的样品中加入足量的强还原剂（如二硫苏糖醇 - DTT）将样品中的所有GSSG还原为GSH。GSSG + DTT → 2GSH + DTT(氧化态)
      • 去除或中和过量的DTT（避免其自身与DTNB反应），常用方法有：酸沉淀后离心取上清、过柱分离、或用NEM再次烷化部分DTT（需严格控制）。
      • 加入DTNB试剂，与新还原产生的GSH发生反应产生TNB⁻黄色产物。
      • 测定412nm处的吸光度。
    • 计算： 该吸光度值代表的是样品中原有GSSG被还原后产生的GSH量（即2倍GSSG量）。因此，样品中的GSSG浓度 = (测得的GSH当量浓度) / 2。同样需要标准曲线（通常用GSH标准品）。
    • 优点： 操作相对简单，试剂易得，成本较低。
    • 缺点： 还原步骤和过量还原剂去除步骤是关键难点，操作不当易引入误差或导致还原不完全；特异性相对酶法略低；灵敏度通常不如酶循环法高。
 

三、 详细实验流程示例 (酶循环法)

以下提供一个通用流程框架，具体参数需根据样品类型和试剂进行调整优化：

1. 试剂配制：
* 酸性沉淀液： 例如 5% (w/v) 偏磷酸（HPO₃）或 5% (w/v) 磺基水杨酸（SSA），含一定浓度（如1-5mM）的EDTA（螯合金属离子）。
* NEM溶液： 例如 100mM NEM（溶于水或缓冲液），新鲜配制或分装-20℃保存。注意：NEM有毒性，操作需防护。
* 中性化缓冲液： 例如 0.1M 磷酸钠缓冲液（pH 7.5），含适量NaOH用于中和酸性。
* GR反应混合液：
* 磷酸盐缓冲液（如0.1M, pH 7.5，含EDTA）
* NADPH溶液（如终浓度~0.2-0.3mM）
* 谷胱甘肽还原酶（GR）溶液（适量活性单位）
* DTNB溶液（如终浓度~0.5-0.6mM） 注：酶循环法中DTNB常作为最终显色剂，但不参与核心循环反应。其作用是捕获循环产生的GSH生成TNB⁻，从而放大信号。
* GSSG标准品溶液： 用中性缓冲液（如0.1M磷酸钠，pH 7.5）配制系列浓度梯度。

2. 样品处理（关键步骤）：
1. 新鲜组织迅速称重，加入预冷的酸性沉淀液（体积比例如1:5或1:10 w/v），冰浴匀浆。细胞迅速刮取或裂解于预冷酸性沉淀液中。血液样品（肝素/EDTA抗凝）离心分离血浆/血清后，立即加入酸性沉淀液处理。目标：快速终止酶活并固定谷胱甘肽状态。
2. 匀浆液/裂解液/处理过的血浆血清样品，在冰上静置5-10分钟。
3. 4℃下高速离心（如12000-14000g，10分钟），取上清液（含酸溶性谷胱甘肽）。
4. 立即取适量上清液，加入适量体积的NEM溶液（终浓度常为5-20mM），涡旋混匀，冰上避光孵育5-15分钟（需优化确保完全烷化GSH）。
5. 加入适量体积的中和缓冲液（含NaOH），混匀，将pH调至中性（约7.0-7.5），此时样品可用于GR反应。注意：中和过程可能产生盐沉淀，必要时需离心取上清。

3. 酶循环法测定GSSG：
1. 在比色皿或微孔板中，加入：
* 适量（如980μL）的GR反应混合液（已含缓冲液、NADPH、GR、DTNB）
* 适量（如20μL）经步骤2处理（烷化并中和）的样品或GSSG标准品。
2. 迅速混匀，立即放入分光光度计（或酶标仪）。
3. 在340nm波长下（或412nm波长下，如果主要监测DTNB显色），连续监测吸光度（OD）变化3-5分钟，记录吸光度随时间下降（340nm）或上升（412nm）的速率（ΔOD/min）。
4. 计算：
* 根据GSSG标准品的ΔOD/min值绘制标准曲线（ΔOD/min vs. GSSG浓度）。
* 根据样品的ΔOD/min值，从标准曲线上查得对应的GSSG浓度。
* 重要校正： 因样品已烷化，测得的GSSG浓度即是原始样品中的GSSG浓度。最终结果需根据原始样品的体积/重量和稀释倍数换算为单位浓度（如μM）或单位重量/细胞数下的含量（如nmol/mg蛋白，nmol/10⁶细胞）。

4. 总谷胱甘肽（GST）含量的平行测定：
* 取另一份未经NEM处理但同样经酸性去蛋白化和中和的样品上清液。
* 在反应体系中加入GR反应混合液（含NADPH和GR），但不加NEM。
* 此时，反应体系中的GR会将样品中的所有GSSG还原为GSH，同时样品中原有的GSH和还原生成的GSH会被DTNB显色。
* GSSG(sample) + NADPH + H⁺ → 2GSH + NADP⁺ (GR催化)
* 2GSH + DTNB → GSSG + 2TNB⁻ (黄色，412nm)
* GSH(existing) + DTNB → 1/2 GSSG + TNB⁻ (黄色，412nm)
* 因此，测得的吸光度变化（通常测412nm ΔOD/min）代表样品中总谷胱甘肽（GST = GSH + 2*GSSG原始）的量。计算原理同GSSG，标准品通常用GSH。
* 计算GSH： GSH浓度 = GST浓度 - 2 * GSSG浓度

四、 关键注意事项

  1. 速度是关键： 样品收集后必须立即进行预处理（酸化和/或冷冻），以最大程度减少离体后GSH的氧化。实验操作需全程在冰上或低温环境进行。
  2. 彻底烷化： NEM烷化GSH必须彻底。需优化NEM浓度和反应时间，并通过对照实验验证（如测定不含NEM处理的样品中残留GSH对GSSG测定的干扰）。避免NEM过量抑制GR。
  3. pH控制： GR在中性pH附近（~7.5）活性最佳。酸沉淀后的样品必须充分中和至所需pH，并确认中和后无沉淀干扰测定。
  4. 避免还原剂污染： 实验器皿、试剂（特别是缓冲液）需确保不含硫醇类污染物（如β-巯基乙醇，DTT）。
  5. 标准曲线： 每次实验都应随行制作新鲜的标准曲线。
  6. 对照设置：
    • 试剂空白： 除样品外，包含所有试剂。用于扣除背景。
    • 样品空白： 处理样品时不加GR或NADPH（视具体方法而定），用于扣除样品自身在测定波长的吸光度。
    • 回收率实验： 在样品中加入已知量GSSG标准品，测定回收率以评估方法准确性。
  7. 样品稳定性： 酸提取物在4℃或-20℃下可短时间储存，但建议尽快测定。-80℃长期储存也可能影响结果稳定性。
  8. 蛋白含量测定： 若需表达为nmol/mg蛋白，需对原始组织匀浆液或细胞裂解液进行蛋白质浓度测定（如BCA法、Bradford法）。
 

五、 数据分析与应用

  • 直接报告： GSSG浓度、GSH浓度（由GST减去2倍GSSG计算得出）。
  • 核心指标：
    • GSSG/GST比值： GSSG / (GSH + 2*GSSG) 或 GSSG / Total Glutathione。这是反映氧化应激最敏感的指标之一。比值升高表明氧化应激增强。
    • GSH/GSSG比值： GSH / (2*GSSG)。比值下降同样指示氧化应激状态。
  • 应用举例：
    • 评估氧化损伤： 在衰老、神经退行性疾病（阿尔兹海默症、帕金森病）、心血管疾病、糖尿病、炎症性疾病、肿瘤等研究中，检测组织、细胞或体液中GSSG水平及GSH/GSSG比值。
    • 药物/毒物评价： 研究药物或环境毒物（如重金属、农药）对机体氧化还原状态的影响。
    • 抗氧化剂功效研究： 评估膳食补充剂（如维生素C、E，多酚类）或药物是否能改善氧化应激状态。
    • 基础研究： 探索氧化还原信号调控机制。
 

总结：

准确检测GSSG含量是评估细胞和组织氧化还原状态的核心技术。酶循环法凭借其高灵敏度和特异性成为首选方法。实验成功的关键在于严格、快速的样品预处理（尤其是利用NEM高效阻断GSH氧化）以及对实验条件的精确控制（如pH、酶活、还原剂污染）。 将GSSG含量与总谷胱甘肽结合分析，计算GSSG/GST或GSH/GSSG比值，能为氧化应激相关研究提供强有力的生化依据。严格遵守实验规程并设置完善的对照是获得可靠数据的保障。