氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量检测

发布时间:2025-06-28 08:01:39 阅读量:1 作者:生物检测中心

GSSG含量检测:原理、方法与应用

谷胱甘肽(Glutathione)是细胞内最重要的小分子硫醇抗氧化剂之一,主要存在还原型(GSH)和氧化型(GSSG)两种形式。GSSG含量及其与总谷胱甘肽(GSH + GSSG)的比值(GSSG/GST)是评估细胞内氧化应激状态的敏感生物标志物。准确检测GSSG含量对于研究氧化还原稳态、疾病机制、药物毒理及营养干预等至关重要。

一、 GSSG的生化意义

  • 氧化还原稳态指示器: 正常情况下,细胞GSH/GSSG比值很高(>100:1),维持强还原环境。氧化应激(如活性氧/氮物种ROS/RNS增加)会消耗GSH生成GSSG,导致GSSG积累和GSH/GSSG比值下降。
  • 硫醇-二硫化物交换调节: GSSG参与蛋白质硫醇-二硫键交换反应,影响蛋白质结构和功能。
  • 信号转导: 谷胱甘肽氧化还原状态的变化参与调控多种信号通路(如NF-κB、AP-1)。
 

二、 GSSG含量检测原理与常用方法

检测GSSG的核心挑战在于:

  1. 细胞内GSSG含量远低于GSH(通常<1%总谷胱甘肽)。
  2. 样品处理过程中GSH极易自发氧化成GSSG,导致假阳性。
  3. 需要特异性区分GSH和GSSG。
 

常用策略是:

  1. 阻断GSH氧化: 使用烷化剂(如N-乙基马来酰亚胺 - NEM)快速、不可逆地与样品中的GSH结合,阻止其氧化为GSSG。
  2. 特异性测定GSSG: 测定经烷化处理的样品中的GSSG含量。
  3. 间接计算或直接测定GSH: 测定总谷胱甘肽(GST = GSH + 2GSSG)含量,然后计算GSH(GSH = GST - 2GSSG),或者使用特异性方法测定未经烷化样品中的GSH。
 

主流检测方法:

  1. 酶循环法 (基于谷胱甘肽还原酶 - GR):

    • 原理: 是目前最常用、灵敏且相对特异的GSSG检测方法。
    • 步骤:
      • 样品快速预处理与烷化: 样品(组织匀浆液、细胞裂解液、血浆/血清等)采集后立即加入含有酸性试剂(如偏磷酸、磺基水杨酸)和NEM的溶液进行去蛋白化和烷化GSH。冰上孵育使NEM充分反应(通常5-15分钟)。随后中和或稀释样品以进行后续酶反应。
      • 酶促反应:
        • 在含有NADPH(还原型辅酶Ⅱ)和谷胱甘肽还原酶(GR)的反应体系中,加入处理好的样品。
        • GR催化反应:GSSG + NADPH + H⁺ → 2GSH + NADP⁺
        • NADPH的消耗速率与样品中GSSG浓度成正比(340nm处吸光度下降速率ΔA/min)。
      • 测定: 在分光光度计340nm处监测吸光度随时间的变化。
      • 计算: 根据标准曲线(已知浓度GSSG标准品)计算样品GSSG浓度。
    • 优点: 灵敏度高、特异性好(只检测GSSG底物)、线性范围宽、步骤标准化程度高。
    • 关键注意事项: NEM浓度和反应时间必须优化以确保完全烷化GSH且不过量(过量NEM可能抑制GR活性);中和步骤要彻底,避免酸性环境抑制酶活;NADPH稳定性需保证。
  2. DTNB(Ellman试剂)衍生化法:

    • 原理: DTNB(5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸))与硫醇基团(-SH)反应生成黄色的2-硝基-5-硫代苯甲酸阴离子(TNB⁻),在412nm处有强吸收。
    • 步骤:
      • 样品经酸性去蛋白化后,必须先用NEM烷化所有GSH(防止其干扰GSSG测定)。
      • 还原步骤: 在烷化后的样品中加入足量的强还原剂(如二硫苏糖醇 - DTT)将样品中的所有GSSG还原为GSH。GSSG + DTT → 2GSH + DTT(氧化态)
      • 去除或中和过量的DTT(避免其自身与DTNB反应),常用方法有:酸沉淀后离心取上清、过柱分离、或用NEM再次烷化部分DTT(需严格控制)。
      • 加入DTNB试剂,与新还原产生的GSH发生反应产生TNB⁻黄色产物。
      • 测定412nm处的吸光度。
    • 计算: 该吸光度值代表的是样品中原有GSSG被还原后产生的GSH量(即2倍GSSG量)。因此,样品中的GSSG浓度 = (测得的GSH当量浓度) / 2。同样需要标准曲线(通常用GSH标准品)。
    • 优点: 操作相对简单,试剂易得,成本较低。
    • 缺点: 还原步骤和过量还原剂去除步骤是关键难点,操作不当易引入误差或导致还原不完全;特异性相对酶法略低;灵敏度通常不如酶循环法高。
 

三、 详细实验流程示例 (酶循环法)

以下提供一个通用流程框架,具体参数需根据样品类型和试剂进行调整优化:

1. 试剂配制:
* 酸性沉淀液: 例如 5% (w/v) 偏磷酸(HPO₃)或 5% (w/v) 磺基水杨酸(SSA),含一定浓度(如1-5mM)的EDTA(螯合金属离子)。
* NEM溶液: 例如 100mM NEM(溶于水或缓冲液),新鲜配制或分装-20℃保存。注意:NEM有毒性,操作需防护。
* 中性化缓冲液: 例如 0.1M 磷酸钠缓冲液(pH 7.5),含适量NaOH用于中和酸性。
* GR反应混合液:
* 磷酸盐缓冲液(如0.1M, pH 7.5,含EDTA)
* NADPH溶液(如终浓度~0.2-0.3mM)
* 谷胱甘肽还原酶(GR)溶液(适量活性单位)
* DTNB溶液(如终浓度~0.5-0.6mM) 注:酶循环法中DTNB常作为最终显色剂,但不参与核心循环反应。其作用是捕获循环产生的GSH生成TNB⁻,从而放大信号。
* GSSG标准品溶液: 用中性缓冲液(如0.1M磷酸钠,pH 7.5)配制系列浓度梯度。

2. 样品处理(关键步骤):
1. 新鲜组织迅速称重,加入预冷的酸性沉淀液(体积比例如1:5或1:10 w/v),冰浴匀浆。细胞迅速刮取或裂解于预冷酸性沉淀液中。血液样品(肝素/EDTA抗凝)离心分离血浆/血清后,立即加入酸性沉淀液处理。目标:快速终止酶活并固定谷胱甘肽状态。
2. 匀浆液/裂解液/处理过的血浆血清样品,在冰上静置5-10分钟。
3. 4℃下高速离心(如12000-14000g,10分钟),取上清液(含酸溶性谷胱甘肽)。
4. 立即取适量上清液,加入适量体积的NEM溶液(终浓度常为5-20mM),涡旋混匀,冰上避光孵育5-15分钟(需优化确保完全烷化GSH)。
5. 加入适量体积的中和缓冲液(含NaOH),混匀,将pH调至中性(约7.0-7.5),此时样品可用于GR反应。注意:中和过程可能产生盐沉淀,必要时需离心取上清。

3. 酶循环法测定GSSG:
1. 在比色皿或微孔板中,加入:
* 适量(如980μL)的GR反应混合液(已含缓冲液、NADPH、GR、DTNB)
* 适量(如20μL)经步骤2处理(烷化并中和)的样品或GSSG标准品。
2. 迅速混匀,立即放入分光光度计(或酶标仪)。
3. 在340nm波长下(或412nm波长下,如果主要监测DTNB显色),连续监测吸光度(OD)变化3-5分钟,记录吸光度随时间下降(340nm)或上升(412nm)的速率(ΔOD/min)。
4. 计算:
* 根据GSSG标准品的ΔOD/min值绘制标准曲线(ΔOD/min vs. GSSG浓度)。
* 根据样品的ΔOD/min值,从标准曲线上查得对应的GSSG浓度。
* 重要校正: 因样品已烷化,测得的GSSG浓度即是原始样品中的GSSG浓度。最终结果需根据原始样品的体积/重量和稀释倍数换算为单位浓度(如μM)或单位重量/细胞数下的含量(如nmol/mg蛋白,nmol/10⁶细胞)。

4. 总谷胱甘肽(GST)含量的平行测定:
* 取另一份未经NEM处理但同样经酸性去蛋白化和中和的样品上清液。
* 在反应体系中加入GR反应混合液(含NADPH和GR),但不加NEM。
* 此时,反应体系中的GR会将样品中的所有GSSG还原为GSH,同时样品中原有的GSH和还原生成的GSH会被DTNB显色。
* GSSG(sample) + NADPH + H⁺ → 2GSH + NADP⁺ (GR催化)
* 2GSH + DTNB → GSSG + 2TNB⁻ (黄色,412nm)
* GSH(existing) + DTNB → 1/2 GSSG + TNB⁻ (黄色,412nm)
* 因此,测得的吸光度变化(通常测412nm ΔOD/min)代表样品中总谷胱甘肽(GST = GSH + 2*GSSG原始)的量。计算原理同GSSG,标准品通常用GSH。
* 计算GSH: GSH浓度 = GST浓度 - 2 * GSSG浓度

四、 关键注意事项

  1. 速度是关键: 样品收集后必须立即进行预处理(酸化和/或冷冻),以最大程度减少离体后GSH的氧化。实验操作需全程在冰上或低温环境进行。
  2. 彻底烷化: NEM烷化GSH必须彻底。需优化NEM浓度和反应时间,并通过对照实验验证(如测定不含NEM处理的样品中残留GSH对GSSG测定的干扰)。避免NEM过量抑制GR。
  3. pH控制: GR在中性pH附近(~7.5)活性最佳。酸沉淀后的样品必须充分中和至所需pH,并确认中和后无沉淀干扰测定。
  4. 避免还原剂污染: 实验器皿、试剂(特别是缓冲液)需确保不含硫醇类污染物(如β-巯基乙醇,DTT)。
  5. 标准曲线: 每次实验都应随行制作新鲜的标准曲线。
  6. 对照设置:
    • 试剂空白: 除样品外,包含所有试剂。用于扣除背景。
    • 样品空白: 处理样品时不加GR或NADPH(视具体方法而定),用于扣除样品自身在测定波长的吸光度。
    • 回收率实验: 在样品中加入已知量GSSG标准品,测定回收率以评估方法准确性。
  7. 样品稳定性: 酸提取物在4℃或-20℃下可短时间储存,但建议尽快测定。-80℃长期储存也可能影响结果稳定性。
  8. 蛋白含量测定: 若需表达为nmol/mg蛋白,需对原始组织匀浆液或细胞裂解液进行蛋白质浓度测定(如BCA法、Bradford法)。
 

五、 数据分析与应用

  • 直接报告: GSSG浓度、GSH浓度(由GST减去2倍GSSG计算得出)。
  • 核心指标:
    • GSSG/GST比值: GSSG / (GSH + 2*GSSG)GSSG / Total Glutathione。这是反映氧化应激最敏感的指标之一。比值升高表明氧化应激增强。
    • GSH/GSSG比值: GSH / (2*GSSG)。比值下降同样指示氧化应激状态。
  • 应用举例:
    • 评估氧化损伤: 在衰老、神经退行性疾病(阿尔兹海默症、帕金森病)、心血管疾病、糖尿病、炎症性疾病、肿瘤等研究中,检测组织、细胞或体液中GSSG水平及GSH/GSSG比值。
    • 药物/毒物评价: 研究药物或环境毒物(如重金属、农药)对机体氧化还原状态的影响。
    • 抗氧化剂功效研究: 评估膳食补充剂(如维生素C、E,多酚类)或药物是否能改善氧化应激状态。
    • 基础研究: 探索氧化还原信号调控机制。
 

总结:

准确检测GSSG含量是评估细胞和组织氧化还原状态的核心技术。酶循环法凭借其高灵敏度和特异性成为首选方法。实验成功的关键在于严格、快速的样品预处理(尤其是利用NEM高效阻断GSH氧化)以及对实验条件的精确控制(如pH、酶活、还原剂污染)。 将GSSG含量与总谷胱甘肽结合分析,计算GSSG/GST或GSH/GSSG比值,能为氧化应激相关研究提供强有力的生化依据。严格遵守实验规程并设置完善的对照是获得可靠数据的保障。