氧化型/脱氢抗坏血酸(DHA)含量检测

氧化型/脱氢抗坏血酸(DHA)含量检测方法

原理概述
脱氢抗坏血酸（Dehydroascorbic acid, DHA）是抗坏血酸（维生素C）的氧化形式。其检测通常基于特定还原剂将其还原为抗坏血酸后间接测定，或利用其与特定显色试剂的直接反应。本文采用2,4-二硝基苯肼（DNPH）比色法，原理如下：

1. 还原步骤（可选）： 若待测样品中同时存在还原型抗坏血酸（ASA），需在测定前加入还原剂（如二硫苏糖醇DTT或半胱氨酸）将所有ASA转化为DHA，以测得总抗坏血酸（ASA + DHA）含量；单独测定样品中DHA时，需先用螯合剂（如乙二酸）掩蔽ASA防止其氧化干扰。
2. DNPH反应： DHA在酸性条件下与2,4-二硝基苯肼（DNPH）发生脱水缩合反应，生成具有特定吸收峰（约520nm）的红色腙类衍生物。
3. 比色定量： 该红色衍生物在浓硫酸溶液中显色稳定，其颜色深度与DHA浓度成正比，可通过分光光度计进行定量测定。

材料与试剂
(注：所有试剂均为分析纯)

1. DNPH溶液 (20 g/L)： 准确称取2.0 g 2,4-二硝基苯肼，溶于100 mL 约4.5 mol/L 的硫酸溶液中（将250 mL浓硫酸缓慢加入700 mL水中，冷却后定容至1000 mL即为4.5 mol/L硫酸。取此硫酸溶液100 mL溶解DNPH）。
2. 硫酸溶液 (855 mL/L)： 极度小心！ 缓慢将855 mL浓硫酸边搅拌边加入到145 mL冰蒸馏水中，冷却备用（此溶液浓度约为16 mol/L）。
3. 乙二酸溶液 (20 g/L)： 溶解2.0 g乙二酸于水中，定容至100 mL（用于掩蔽ASA）。
4. DHA标准储备液 (1 mg/mL)： 精确称取约50 mg结晶纯品DHA（或精确称量相当量的可溶性盐如DHA钠盐，换算成DHA含量），用20 g/L乙二酸溶液溶解并定容至50 mL棕色容量瓶中，4℃避光保存（此为标准储备液）。临用前用20 g/L乙二酸溶液稀释配制所需浓度的标准工作液（如10 μg/mL, 20 μg/mL, 50 μg/mL等）。
5. 20 g/L 乙二酸溶液： 同试剂3，作为提取液和稀释液。

仪器设备

1. 分光光度计（带520nm波长）
2. 恒温水浴锅（35±1℃）
3. 离心机（≥4000 rpm）
4. 分析天平（精度0.0001g）
5. 涡旋混合器
6. 移液器（不同量程）
7. 具塞离心管（10-15 mL）
8. 试管（具塞或普通）
9. 容量瓶（50 mL、100 mL等）
10. 滤纸或0.45μm/0.22μm微孔滤膜（必要时）

样品处理

1. 取样与匀浆： 代表性样品（如水果、蔬菜组织）洗净擦干，迅速切碎混匀。精确称取适量（如1.0-5.0g，根据预期DHA含量调整）于预冷的研钵或匀浆器中。
2. 提取： 加入预冷的20 g/L乙二酸溶液（体积根据样品量确定，通常按1：5-1：10 w/v），冰浴条件下充分研磨或匀浆至组织破碎。
3. 离心/过滤： 将匀浆液转移至离心管，4℃、4000 rpm离心15分钟。取上清液，必要时用20 g/L乙二酸溶液适当稀释（记为样品提取液）。若上清液浑浊，可过0.45μm滤膜。
4. ASA掩蔽（单独测DHA时必需）： 取适量样品提取液，加入适量20 g/L乙二酸溶液（确保最终浓度一致），混匀后备用（此步加入乙二酸主要作用是稳定和掩蔽ASA，防止其氧化成DHA干扰测定）。

标准曲线绘制

1. 取数支干净试管，按下表加入试剂（单位：mL）：

   管号	DHA标准工作液 (10 μg/mL)	20 g/L 乙二酸溶液	DNPH溶液 (20 g/L)	相当DHA含量 (μg)
   S0	0.0 (空白)	1.0	0.5	0
   S1	0.2	0.8	0.5	2
   S2	0.4	0.6	0.5	4
   S3	0.6	0.4	0.5	6
   S4	0.8	0.2	0.5	8
   S5	1.0	0.0	0.5	10

2. 反应： 盖紧试管塞（或用Parafilm封口），充分涡旋混匀。置于35±1℃恒温水浴中避光反应90分钟。

3. 终止与显色： 将试管从水浴中取出，立即放入冰水浴中冷却5分钟。缓慢、逐滴沿管壁加入2.5 mL冰冷的855 mL/L硫酸溶液（操作务必小心，避免剧烈放热和飞溅！），边加边轻摇混匀（动作要柔和）。加完后，继续在冰水浴中静置15-30分钟。

4. 比色： 室温平衡至室温（约需30分钟）。用1cm光径比色皿，以S0管（0号管，空白）调零，在520nm波长下测定各标准管（S1-S5）的吸光度值（OD₅₂₀）。

5. 绘制曲线： 以DHA含量（μg）为横坐标(X)，测得的OD₅₂₀值为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，获得线性回归方程（Y = aX + b）和相关系数（R²应≥0.995）。

样品测定

1. 取两支干净试管（平行样）。
2. 各加入1.0 mL经过“ASA掩蔽”处理的样品提取液（或稀释液）。
3. 反应： 向每管中加入0.5 mL DNPH溶液（20 g/L），盖紧塞子，涡旋混匀。置于35±1℃恒温水浴中避光反应90分钟（与标准曲线同步进行）。
4. 终止与显色： 同标准曲线步骤（冰浴冷却5分钟，缓慢、逐滴加入2.5 mL冰冷的855 mL/L硫酸溶液，冰浴静置15-30分钟）。
5. 比色： 同标准曲线步骤（室温平衡至室温，以空白管调零，测定样品管OD₅₂₀值）。

结果计算

1. 根据待测样品管的平均吸光度值（OD_样品），代入标准曲线回归方程（Y = aX + b），计算出该测定体积（1.0 mL提取液）中所含DHA的质量（μg），记为m。
   m = (OD<sub>样品</sub> - b) / a

2. 样品中DHA含量计算：

   • 按鲜重计（μg/g）：
     DHA含量 = (m * V * D) / (W * V₁)
   • 按干重计（μg/g）： (若需报告干基含量，需另测样品干物质含量)
     DHA含量 = (m * V * D) / (W * (1 - MC%) * V₁)
   • 按体积计（μg/mL）： (适用于液体样品如果汁)
     DHA含量 = (m * D) / V₁
    

   式中：

   • m：由标准曲线计算出的1.0 mL样品测定液中的DHA质量（μg）。
   • V：样品提取液总体积（mL）。
   • D：样品测定前的稀释倍数（如未稀释则为1）。
   • W：样品鲜重（g）。
   • V₁：用于显色反应的样品提取液体积（本方法为1.0 mL）。
   • MC%：样品含水率（%）。

注意事项与关键点

1. 安全第一！ 浓硫酸和DNPH均具强腐蚀性/毒性。操作务必在通风橱内进行，佩戴防护眼镜、实验服和耐酸碱手套。加酸时需高度谨慎，缓慢滴加并轻摇降温，防止剧烈反应喷溅。
2. 温度控制： 反应温度（35℃）和时间（90分钟）需精确控制，直接影响显色效率和稳定性。冰浴冷却步骤对保护显色产物和防止暴沸至关重要。
3. 显色时间： 加入浓硫酸显色后，应在冰浴中静置足够时间（15-30分钟）确保充分显色和降温。室温平衡时间也应一致。
4. 避免ASA干扰： 单独测定DHA时，“ASA掩蔽”步骤（加入足够量乙二酸溶液）是必需的，否则ASA会在反应过程中氧化成DHA导致结果显著偏高。
5. 样品提取： 提取过程需快速、低温进行，使用乙二酸溶液稳定维生素C形态并抑制酶活（如抗坏血酸氧化酶）。避免金属离子污染。
6. 避光操作： DHA对光敏感，标准品储存、样品提取及反应过程应尽量避光。
7. 空白对照： 样品空白（不加DNPH，用等量乙二酸或水代替）有助于评估样品基质背景干扰，但本方法空白（S0）通常已足够。
8. 线性范围： 确保样品的吸光度值落在标准曲线的线性范围内（通常在0-10μg DHA/管）。超出范围需稀释样品提取液重新测定。
9. 仪器调零: 务必使用试剂空白（S0管）准确调零。
10. 废液处理： 实验中产生的含DNPH和浓硫酸的废液属于危险废物，需按实验室规定集中收集处理，不可直接倒入下水道。

讨论

• 方法选择： DNPH法灵敏度较高、设备要求相对简单、成本较低，适合大批量样品分析。但其步骤相对繁琐，对操作细节要求严格。
• 特异性： DNPH可与多种醛酮类物质反应。虽然在维生素C测定体系中干扰相对较少，但在复杂样品基质（如深色果蔬、发酵产品）中可能存在干扰，需结合样品空白或考虑更特异的方法（如HPLC）。
• 与总Vc关系： 本方法描述的是单独测定DHA。若需测定总抗坏血酸（TAA = ASA + DHA），需在样品提取后，分两部分处理：一部分加还原剂（如DTT）将DHA还原为ASA后测ASA（可用同样DNPH法或其他测ASA的方法）；另一部分按本文方法测DHA（需掩蔽ASA）。也可先测总Vc（将所有形态还原为ASA后测），再单独测DHA，ASA = TAA - DHA。
• 稳定性： DHA在溶液中不如ASA稳定，尤其在高温、碱性或含金属离子条件下易降解。快速处理样品和使用含螯合剂的酸性提取液至关重要。

结论
采用2,4-二硝基苯肼（DNPH）比色法是检测脱氢抗坏血酸（DHA）含量的经典方法。通过严格控制反应条件（温度、时间、酸度）、确保ASA的有效掩蔽、精确操作及规范废液处理，该方法能够相对准确、可靠地测定各类生物样品中的DHA含量，为评价食品、植物组织等的氧化状态及维生素C代谢研究提供重要数据支撑。实际应用中应充分考虑样品特性和潜在干扰，必要时进行方法学验证。