氧化型/脱氢抗坏血酸(DHA)含量检测

发布时间:2025-06-28 08:01:39 阅读量:2 作者:生物检测中心

氧化型/脱氢抗坏血酸(DHA)含量检测方法

原理概述
脱氢抗坏血酸(Dehydroascorbic acid, DHA)是抗坏血酸(维生素C)的氧化形式。其检测通常基于特定还原剂将其还原为抗坏血酸后间接测定,或利用其与特定显色试剂的直接反应。本文采用2,4-二硝基苯肼(DNPH)比色法,原理如下:

  1. 还原步骤(可选): 若待测样品中同时存在还原型抗坏血酸(ASA),需在测定前加入还原剂(如二硫苏糖醇DTT或半胱氨酸)将所有ASA转化为DHA,以测得总抗坏血酸(ASA + DHA)含量;单独测定样品中DHA时,需先用螯合剂(如乙二酸)掩蔽ASA防止其氧化干扰。
  2. DNPH反应: DHA在酸性条件下与2,4-二硝基苯肼(DNPH)发生脱水缩合反应,生成具有特定吸收峰(约520nm)的红色腙类衍生物。
  3. 比色定量: 该红色衍生物在浓硫酸溶液中显色稳定,其颜色深度与DHA浓度成正比,可通过分光光度计进行定量测定。
 

材料与试剂
(注:所有试剂均为分析纯)

  1. DNPH溶液 (20 g/L): 准确称取2.0 g 2,4-二硝基苯肼,溶于100 mL 约4.5 mol/L 的硫酸溶液中(将250 mL浓硫酸缓慢加入700 mL水中,冷却后定容至1000 mL即为4.5 mol/L硫酸。取此硫酸溶液100 mL溶解DNPH)。
  2. 硫酸溶液 (855 mL/L): 极度小心! 缓慢将855 mL浓硫酸边搅拌边加入到145 mL冰蒸馏水中,冷却备用(此溶液浓度约为16 mol/L)。
  3. 乙二酸溶液 (20 g/L): 溶解2.0 g乙二酸于水中,定容至100 mL(用于掩蔽ASA)。
  4. DHA标准储备液 (1 mg/mL): 精确称取约50 mg结晶纯品DHA(或精确称量相当量的可溶性盐如DHA钠盐,换算成DHA含量),用20 g/L乙二酸溶液溶解并定容至50 mL棕色容量瓶中,4℃避光保存(此为标准储备液)。临用前用20 g/L乙二酸溶液稀释配制所需浓度的标准工作液(如10 μg/mL, 20 μg/mL, 50 μg/mL等)。
  5. 20 g/L 乙二酸溶液: 同试剂3,作为提取液和稀释液。
 

仪器设备

  1. 分光光度计(带520nm波长)
  2. 恒温水浴锅(35±1℃)
  3. 离心机(≥4000 rpm)
  4. 分析天平(精度0.0001g)
  5. 涡旋混合器
  6. 移液器(不同量程)
  7. 具塞离心管(10-15 mL)
  8. 试管(具塞或普通)
  9. 容量瓶(50 mL、100 mL等)
  10. 滤纸或0.45μm/0.22μm微孔滤膜(必要时)
 

样品处理

  1. 取样与匀浆: 代表性样品(如水果、蔬菜组织)洗净擦干,迅速切碎混匀。精确称取适量(如1.0-5.0g,根据预期DHA含量调整)于预冷的研钵或匀浆器中。
  2. 提取: 加入预冷的20 g/L乙二酸溶液(体积根据样品量确定,通常按1:5-1:10 w/v),冰浴条件下充分研磨或匀浆至组织破碎。
  3. 离心/过滤: 将匀浆液转移至离心管,4℃、4000 rpm离心15分钟。取上清液,必要时用20 g/L乙二酸溶液适当稀释(记为样品提取液)。若上清液浑浊,可过0.45μm滤膜。
  4. ASA掩蔽(单独测DHA时必需): 取适量样品提取液,加入适量20 g/L乙二酸溶液(确保最终浓度一致),混匀后备用(此步加入乙二酸主要作用是稳定和掩蔽ASA,防止其氧化成DHA干扰测定)。
 

标准曲线绘制

  1. 取数支干净试管,按下表加入试剂(单位:mL):

    管号 DHA标准工作液 (10 μg/mL) 20 g/L 乙二酸溶液 DNPH溶液 (20 g/L) 相当DHA含量 (μg)
    S0 0.0 (空白) 1.0 0.5 0
    S1 0.2 0.8 0.5 2
    S2 0.4 0.6 0.5 4
    S3 0.6 0.4 0.5 6
    S4 0.8 0.2 0.5 8
    S5 1.0 0.0 0.5 10
  2. 反应: 盖紧试管塞(或用Parafilm封口),充分涡旋混匀。置于35±1℃恒温水浴中避光反应90分钟。

  3. 终止与显色: 将试管从水浴中取出,立即放入冰水浴中冷却5分钟。缓慢、逐滴沿管壁加入2.5 mL冰冷的855 mL/L硫酸溶液(操作务必小心,避免剧烈放热和飞溅!),边加边轻摇混匀(动作要柔和)。加完后,继续在冰水浴中静置15-30分钟。

  4. 比色: 室温平衡至室温(约需30分钟)。用1cm光径比色皿,以S0管(0号管,空白)调零,在520nm波长下测定各标准管(S1-S5)的吸光度值(OD<sub>520</sub>)。

  5. 绘制曲线: 以DHA含量(μg)为横坐标(X),测得的OD<sub>520</sub>值为纵坐标(Y),绘制标准曲线,获得线性回归方程(Y = aX + b)和相关系数(R²应≥0.995)。

 

样品测定

  1. 取两支干净试管(平行样)。
  2. 各加入1.0 mL经过“ASA掩蔽”处理的样品提取液(或稀释液)。
  3. 反应: 向每管中加入0.5 mL DNPH溶液(20 g/L),盖紧塞子,涡旋混匀。置于35±1℃恒温水浴中避光反应90分钟(与标准曲线同步进行)。
  4. 终止与显色: 同标准曲线步骤(冰浴冷却5分钟,缓慢、逐滴加入2.5 mL冰冷的855 mL/L硫酸溶液,冰浴静置15-30分钟)。
  5. 比色: 同标准曲线步骤(室温平衡至室温,以空白管调零,测定样品管OD<sub>520</sub>值)。
 

结果计算

  1. 根据待测样品管的平均吸光度值(OD<sub>样品</sub>),代入标准曲线回归方程(Y = aX + b),计算出该测定体积(1.0 mL提取液)中所含DHA的质量(μg),记为m。
    m = (OD<sub>样品</sub> - b) / a

  2. 样品中DHA含量计算:

    • 按鲜重计(μg/g):
      DHA含量 = (m * V * D) / (W * V₁)
    • 按干重计(μg/g): (若需报告干基含量,需另测样品干物质含量)
      DHA含量 = (m * V * D) / (W * (1 - MC%) * V₁)
    • 按体积计(μg/mL): (适用于液体样品如果汁)
      DHA含量 = (m * D) / V₁
     

    式中:

    • m:由标准曲线计算出的1.0 mL样品测定液中的DHA质量(μg)。
    • V:样品提取液总体积(mL)。
    • D:样品测定前的稀释倍数(如未稀释则为1)。
    • W:样品鲜重(g)。
    • V₁:用于显色反应的样品提取液体积(本方法为1.0 mL)。
    • MC%:样品含水率(%)。
 

注意事项与关键点

  1. 安全第一! 浓硫酸和DNPH均具强腐蚀性/毒性。操作务必在通风橱内进行,佩戴防护眼镜、实验服和耐酸碱手套。加酸时需高度谨慎,缓慢滴加并轻摇降温,防止剧烈反应喷溅。
  2. 温度控制: 反应温度(35℃)和时间(90分钟)需精确控制,直接影响显色效率和稳定性。冰浴冷却步骤对保护显色产物和防止暴沸至关重要。
  3. 显色时间: 加入浓硫酸显色后,应在冰浴中静置足够时间(15-30分钟)确保充分显色和降温。室温平衡时间也应一致。
  4. 避免ASA干扰: 单独测定DHA时,“ASA掩蔽”步骤(加入足够量乙二酸溶液)是必需的,否则ASA会在反应过程中氧化成DHA导致结果显著偏高。
  5. 样品提取: 提取过程需快速、低温进行,使用乙二酸溶液稳定维生素C形态并抑制酶活(如抗坏血酸氧化酶)。避免金属离子污染。
  6. 避光操作: DHA对光敏感,标准品储存、样品提取及反应过程应尽量避光。
  7. 空白对照: 样品空白(不加DNPH,用等量乙二酸或水代替)有助于评估样品基质背景干扰,但本方法空白(S0)通常已足够。
  8. 线性范围: 确保样品的吸光度值落在标准曲线的线性范围内(通常在0-10μg DHA/管)。超出范围需稀释样品提取液重新测定。
  9. 仪器调零: 务必使用试剂空白(S0管)准确调零。
  10. 废液处理: 实验中产生的含DNPH和浓硫酸的废液属于危险废物,需按实验室规定集中收集处理,不可直接倒入下水道。
 

讨论

  • 方法选择: DNPH法灵敏度较高、设备要求相对简单、成本较低,适合大批量样品分析。但其步骤相对繁琐,对操作细节要求严格。
  • 特异性: DNPH可与多种醛酮类物质反应。虽然在维生素C测定体系中干扰相对较少,但在复杂样品基质(如深色果蔬、发酵产品)中可能存在干扰,需结合样品空白或考虑更特异的方法(如HPLC)。
  • 与总Vc关系: 本方法描述的是单独测定DHA。若需测定总抗坏血酸(TAA = ASA + DHA),需在样品提取后,分两部分处理:一部分加还原剂(如DTT)将DHA还原为ASA后测ASA(可用同样DNPH法或其他测ASA的方法);另一部分按本文方法测DHA(需掩蔽ASA)。也可先测总Vc(将所有形态还原为ASA后测),再单独测DHA,ASA = TAA - DHA。
  • 稳定性: DHA在溶液中不如ASA稳定,尤其在高温、碱性或含金属离子条件下易降解。快速处理样品和使用含螯合剂的酸性提取液至关重要。
 

结论
采用2,4-二硝基苯肼(DNPH)比色法是检测脱氢抗坏血酸(DHA)含量的经典方法。通过严格控制反应条件(温度、时间、酸度)、确保ASA的有效掩蔽、精确操作及规范废液处理,该方法能够相对准确、可靠地测定各类生物样品中的DHA含量,为评价食品、植物组织等的氧化状态及维生素C代谢研究提供重要数据支撑。实际应用中应充分考虑样品特性和潜在干扰,必要时进行方法学验证。