乙酰胆碱酯酶检测:原理、方法与临床意义
乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase, AChE)是神经系统中一种至关重要的酶,主要负责在胆碱能神经突触处快速水解神经递质乙酰胆碱(ACh),终止其信号传递作用。对乙酰胆碱酯酶活性的精确检测在多个医学领域具有重要意义。
一、检测原理
乙酰胆碱酯酶催化乙酰胆碱水解为胆碱和乙酸:
乙酰胆碱 + H₂O → 胆碱 + 乙酸
检测的核心在于量化这一反应过程。常用方法通过以下途径实现:
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底物消耗/产物生成测定:
- 使用人工合成的、更易检测的乙酰胆碱类似物作为底物。
- 最常用的是 硫代乙酰胆碱(Acetylthiocholine, ATCh)。
- 反应: ATCh + H₂O → 硫代胆碱(Thiocholine) + 乙酸
- 检测: 硫代胆碱与显色剂 5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸) (DTNB, Ellman试剂) 反应,生成强黄色的 5-巯基-2-硝基苯甲酸(TNB⁻),在 412 nm 波长处有最大吸收峰。酶活性与单位时间内生成的黄色产物的量(吸光度变化速率 ΔA/min)成正比。
- 另一种方法是利用 乙酰胆碱 直接作为底物,通过检测反应生成的 酸(乙酸)导致的pH变化 来间接反映酶活性(如pH指示剂法)。
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其他方法:
- 羟胺比色法: 残余的乙酰胆碱与羟胺反应生成异羟肟酸,再与铁离子作用形成棕色复合物进行比色。
- 放射性同位素法: 使用放射性标记的乙酰胆碱(如¹⁴C-ACh),检测反应生成的放射性产物(¹⁴C-乙酸或¹⁴C-胆碱)。
- 电化学法: 基于酶反应产生的电活性物质(如硫代胆碱)进行检测。
目前,以硫代乙酰胆碱为底物、DTNB为显色剂的比色法(Ellman法及其改良法)因其灵敏度高、操作简便、成本较低且适用于多种样本类型(全血、血清/血浆、组织匀浆液、红细胞溶血液等),已成为临床和科研实验室检测AChE活性的主流方法。
二、检测样本
检测对象主要是红细胞膜上的 真性胆碱酯酶(AChE) 和血浆中的 假性胆碱酯酶(丁酰胆碱酯酶, BChE):
- 全血: 同时包含红细胞AChE和血浆BChE。常用于筛查接触有机磷/氨基甲酸酯类物质的暴露情况。
- 红细胞: 需将全血去除血浆和白细胞,洗涤红细胞并溶血后测定上清液。测得的是 红细胞AChE活性,能更直接反映神经系统胆碱酯酶的状态,是评估有机磷中毒严重程度和恢复情况的更可靠指标。
- 血浆/血清: 测得的几乎完全是 血浆BChE(假性胆碱酯酶)活性。它对有机磷/氨基甲酸酯类抑制非常敏感,下降出现早,但个体差异大且影响因素多(肝病、遗传变异、妊娠、营养不良等),主要用作早期暴露的敏感筛查指标,其恢复也较快。
- 组织匀浆液(如脑、肌肉): 主要用于科研。
三、主要临床应用
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有机磷和氨基甲酸酯类农药中毒的诊断与监测:
- 核心指标: 这两类化合物是强效的AChE和BChE抑制剂。
- 红细胞AChE活性: 降低程度与中毒严重性和神经系统损伤程度相关性更好。活性降至正常值的30%以下常预示严重中毒。监测其恢复情况对评估疗效和预后至关重要。
- 血浆BChE活性: 对抑制更敏感,接触后下降更快(数小时内),是早期诊断和群体筛查暴露的有效指标。但其活性受多种非中毒因素影响,且恢复较快,不能单独作为判断中毒严重程度和长期恢复的依据。
- 判断依据: 结合明确的接触史、典型的毒蕈碱样和烟碱样症状(流涎、大汗、瞳孔缩小、肌颤、呼吸困难等)以及显著降低的胆碱酯酶活性(特别是红细胞AChE活性)即可确诊。
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罕见遗传性胆碱酯酶异常的筛查:
- 血浆BChE缺乏或变异: 某些遗传变异导致血浆BChE活性极低或产生非典型酶。这类患者在使用肌肉松弛剂(如琥珀胆碱、米库氯铵)时,药物代谢会显著减慢,导致术后呼吸暂停时间异常延长。术前筛查血浆BChE有助于识别高风险患者。
- 红细胞AChE缺乏: 极其罕见,可能伴有神经系统症状。
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辅助诊断某些神经系统疾病(科研探索):
- 研究显示,阿尔茨海默病、亨廷顿病、重症肌无力等疾病患者的脑脊液或特定脑区中AChE活性可能出现变化,但目前其诊断价值有限,主要用于科研探索发病机制或药物效应。
四、结果解读与注意事项
- 正常参考范围: 极其重要的是,不同实验室使用的具体方法(底物浓度、反应温度、pH、测定仪器等)存在差异,建立的正常参考范围也不同。结果解读必须严格参照进行检测的实验室提供的参考区间。通常报告形式为酶活性单位(如U/mL, U/g Hb, U/L, ΔA/min等)。
- 活性降低:
- 首要考虑: 有机磷或氨基甲酸酯类化合物中毒(急性或慢性接触)。活性抑制程度与暴露剂量、毒性及时间相关。
- 其他原因:
- 血浆BChE活性降低: 严重肝病、营养不良、晚期癌症、慢性消耗性疾病、遗传性BChE缺乏/变异、妊娠晚期、部分药物(如口服避孕药、细胞毒性药物、可逆性抗胆碱酯酶药如新斯的明)等。
- 红细胞AChE活性降低: 阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、再生障碍性贫血等导致红细胞异常的疾病(相对少见)。
- 活性升高: 较少见,可见于肾病综合征(血浆BChE可能升高)、肥胖症、甲状腺功能亢进症(部分报道)等。
- 解读关键: 必须结合患者的临床表现、职业/环境暴露史、用药史以及其他相关实验室检查结果进行综合判断。 不能仅凭胆碱酯酶活性下降就诊断中毒,也需排除其他导致活性降低的原因。同样,活性正常也不能完全排除低剂量或早期接触的可能性。
五、检测局限性
- 区分AChE和BChE: 使用全血或特定抑制剂(如BW284c51抑制AChE,氟化钠抑制BChE)有助于区分两种酶的活性。单独检测红细胞AChE或血浆BChE更能提供特异性信息。
- 样本稳定性: 血液样本中的胆碱酯酶活性会随时间推移而下降(尤其是全血和溶血液),尤其是室温下。样本应在采集后尽快分离处理并检测。血浆/血清相对稳定(4°C可保存数天),红细胞溶血液稳定性较差,建议尽早检测。
- 干扰因素: 严重溶血(血红蛋白干扰吸光度测定)、高脂血、某些药物等可能对检测造成干扰。不同检测方法对干扰的敏感性不同。
- 遗传变异影响: 血浆BChE的基线活性存在较大的个体间差异,部分源于遗传多态性。这会影响对“活性降低”程度的判断。
- 不能反映组织(尤其神经突触)AChE活性: 血液检测(红细胞AChE或血浆BChE)只是间接指标,与神经肌肉接头等关键部位的酶活性变化可能存在时间差或不完全平行。
总结
乙酰胆碱酯酶检测,尤其是基于Ellman法的比色检测,是诊断和监测有机磷及氨基甲酸酯类化合物中毒的关键工具。区分检测红细胞乙酰胆碱酯酶(AChE)和血浆丁酰胆碱酯酶(BChE)活性对于准确评估中毒严重程度、指导治疗和判断预后至关重要。此外,该检测在筛查遗传性胆碱酯酶异常(特别是血浆BChE缺乏)以预防麻醉相关风险方面也具有重要价值。解读结果时必须充分考虑检测方法的差异、样本稳定性、个体基线水平差异以及其他干扰因素,并将其紧密结合患者的临床表现和接触史进行综合分析。