中性蛋白酶活性检测 - 中析研究所生物检测中心

中性蛋白酶活性检测方法详解

中性蛋白酶是一类在接近中性pH（通常在pH 6.0-8.0）范围内具有最佳催化活性的蛋白酶。它们在食品加工（如肉类嫩化、烘焙、酿造）、洗涤剂工业、皮革处理、医药及饲料添加剂等领域应用广泛。准确测定其活性是质量控制、工艺优化及基础研究的关键环节。

一、检测原理

最常用且被广泛认可的方法是 福林酚法 (Folin-Ciocalteu法)，其原理基于：

酶促水解反应： 在中性缓冲条件下，中性蛋白酶催化其特异性底物——酪蛋白（Casein）的水解，将大分子酪蛋白分解成可溶性的小分子肽和氨基酸。
反应终止与沉淀： 到达预定反应时间后，加入三氯乙酸（TCA）溶液终止酶反应。TCA使未被水解的酪蛋白及大分子肽变性沉淀，而水解产生的小分子肽和氨基酸则溶解在上清液中。
显色反应： 取含有水解产物的上清液，加入福林酚试剂。福林酚试剂在碱性条件下（加入碳酸钠溶液），可与水解产物中的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸以及肽链中的肽键发生反应，生成蓝色复合物。
比色测定： 该蓝色复合物在波长660 nm处有最大吸收。通过分光光度计测定反应液的吸光度值。吸光度的大小与溶液中水解产物的浓度（即可溶性肽和氨基酸的量）成正比，从而间接反映了中性蛋白酶的催化活性。活性越高，水解产物越多，吸光度值越大。

二、试剂与材料

底物溶液（酪蛋白溶液）： 精确称取一定量酪蛋白（如1.0 g），溶解于预热至反应温度（如40℃）的中性缓冲液（常用0.05 M磷酸盐缓冲液，pH 7.0-7.5）中，定容至100 mL。使用前需确保完全溶解，必要时可轻微加热助溶（避免过热变性），冷却至反应温度。此溶液应新鲜配制或按要求保存。
中性缓冲液： 通常采用0.05 M磷酸盐缓冲液（pH 7.0-7.5）。精确配制，并用pH计校准。
反应终止/沉淀剂： 0.4 M三氯乙酸（TCA）溶液。准确称取TCA，用去离子水溶解定容。
显色试剂：
- 福林酚试剂： 按标准方法配制或使用市售符合要求的试剂。使用前按要求稀释（如用去离子水稀释一倍）。
- 碳酸钠溶液： 0.4 M 碳酸钠（Na₂CO₃）溶液。
标准品（可选）： 酪氨酸标准溶液（如50 µg/mL），用于制作标准曲线（非必须，但推荐用于高精度要求）。
待测酶液： 将待测中性蛋白酶样品用冷的中性缓冲液（如0.05 M磷酸盐缓冲液，pH 7.0）进行适当梯度稀释，使测得的吸光度值在标准曲线线性范围内（通常需预实验确定最佳稀释倍数）。稀释液需保持低温（如冰浴）以维持酶稳定性。
去离子水
仪器设备：
- 恒温水浴锅（控温精度±0.1℃，设定为中性蛋白酶最适温度附近，如40℃）
- 分光光度计（带1 cm光径比色皿）
- 精密计时器
- 离心机（转速3000-4000 rpm）
- pH计
- 分析天平（精度0.0001 g）
- 移液器（精确，如单道、多道）
- 试管（具塞或普通）、离心管、容量瓶、烧杯等玻璃器皿

三、操作步骤

预热： 将底物（酪蛋白）溶液和缓冲液置于40℃恒温水浴中预热至少10分钟。
加样与启动反应：
- 取两支洁净干燥的试管，标记为样品管（S）和空白管（B）。
- 样品管 (S)： 精确加入1.0 mL预热好的酪蛋白底物溶液。置于40℃水浴中平衡2-3分钟。
- 迅速加入1.0 mL 预热至40℃ 的稀释酶液（确保酶液温度已平衡），立即混匀并开始计时。
- 空白管 (B)： 精确加入1.0 mL预热好的酪蛋白底物溶液。置于40℃水浴中平衡2-3分钟。
- 迅速加入1.0 mL 预热至40℃ 的缓冲液（代替酶液），立即混匀并开始计时。
反应： 将两支试管准确置于40℃水浴中反应10分钟（或根据酶活高低预实验确定的最佳时间）。
终止反应： 反应时间到达后，立即向两支试管中各加入2.0 mL冰冷的0.4 M TCA溶液，迅速混匀以终止酶反应并沉淀未水解的蛋白质。
沉淀与分离：
- 将试管静置室温或水浴（如40℃）中10-20分钟，使沉淀完全。
- 将试管内容物转移至离心管中，在3000-4000 rpm下离心10分钟。
显色反应：
- 小心吸取上清液2.0 mL（避免吸入沉淀），加入另一支洁净干燥的试管中。
- 加入5.0 mL 0.4 M 碳酸钠溶液。
- 加入1.0 mL稀释好的福林酚试剂。
- 立即充分混匀。
- 将试管置于室温（或40℃水浴）避光显色20分钟（或根据方法规定时间）。
比色测定： 用分光光度计，在660 nm波长处，以空白管（B）的显色液调零，测定**样品管（S）**显色液的吸光度值（Aₛ）。同时测定空白管（B）的吸光度值（Aᵦ）应非常低（接近零）。

四、结果计算

定义酶活力单位 (U)：
- 最常用定义：在测定条件下（特定pH、温度、时间），每分钟水解酪蛋白产生相当于1 µg酪氨酸（Tyr）的显色物质（即吸光度值相当于1 µg酪氨酸产生的吸光度值）所需的酶量，定义为一个酶活力单位（U）。
利用标准曲线法计算：
- 制作酪氨酸标准曲线： 配制一系列浓度的酪氨酸标准溶液（如0, 10, 20, 30, 40, 50 µg/mL），按上述步骤（从加入TCA开始）进行显色和测定吸光度。以酪氨酸浓度（µg/mL）为横坐标（X），对应的吸光度值（A）为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得到线性回归方程：A = k * C + b（其中C为酪氨酸浓度，µg/mL）。
- 计算样品中相当于酪氨酸的量：
  - 根据样品管吸光度值Aₛ和标准曲线方程，计算出2.0 mL上清液中含有的相当于酪氨酸的量（µg）：Tyr_eq (µg) = (Aₛ - b) / k （此值代表2 mL上清液中的量）。
- 计算酶活力：
  - 该酪氨酸量（Tyr_eq）是在10分钟反应时间内，由1 mL酶液水解底物产生的。
  - 因此，每毫升酶液在每分钟内产生的相当于酪氨酸的量（即酶活力浓度）为：
    酶活力 (U/mL) = [Tyr_eq (µg) / 反应时间 (min)] / 酶液体积 (mL)
    代入数值：酶活力 (U/mL) = [Tyr_eq / 10] / 1 = Tyr_eq / 10
  - 如果待测的是原酶粉或浓缩液，需要根据其稀释倍数（DF）计算原样的酶活力：
    原样酶活力 (U/g 或 U/mL) = 酶活力 (U/mL) * DF * (1 / 样品浓度)
    （样品浓度指配制待测酶液时，每毫升稀释液中所含原样的克数或毫升数）。
利用标准吸光度系数计算（若已知）：
- 如果已知在特定条件下，1 µg酪氨酸产生的吸光度值（即标准吸光度系数K，单位为A·mL/µg），则：
  酶活力 (U/mL) = [(Aₛ - Aᵦ) * V_t * DF] / (K * t * v)
  - Aₛ：样品管吸光度
  - Aᵦ：空白管吸光度（通常很小，有时可近似忽略）
  - V_t：显色反应总体积（本步骤中为2 mL上清液 + 5 mL Na₂CO₃ + 1 mL Folin = 8 mL）
  - DF：从反应上清液到显色测定的稀释倍数（本步骤中取2 mL上清液加入8 mL显色试剂，但通常计算时V_t已包含此体积，DF可视为1）
  - K：标准吸光度系数（µg⁻¹·mL⁻¹·A⁻¹，即每µg酪氨酸在特定条件下产生的吸光度值）
  - t：酶促反应时间（min）
  - v：反应体系中加入的酶液体积（mL）
- 简化代入本方法参数（忽略Aᵦ）：
  酶活力 (U/mL) ≈ [Aₛ * 8] / (K * 10 * 1) = (0.8 * Aₛ) / K
  - 其中K值需要根据所用福林酚试剂和仪器条件通过标准曲线确定。

五、注意事项

温度控制： 酶促反应对温度极其敏感，务必保证水浴温度精确稳定（±0.1℃），所有试剂（底物、酶液、缓冲液）加入前需预热/预冷至反应温度。
时间控制： 反应时间、显色时间必须精确计时。加入TCA终止反应的操作要迅速。
pH控制： 缓冲液的pH值必须准确配制并校准，确保反应体系pH在目标中性范围内。
底物浓度： 酪蛋白溶液需完全溶解，避免结块。浓度需准确，并确保在反应体系中不过量也不不足（通常保证零级反应动力学）。
酶液稀释： 稀释倍数至关重要，应使测得的吸光度值在标准曲线的线性范围内（通常在0.1-0.8之间）。过高或过低均影响准确性。稀释液应为冷缓冲液，操作在冰浴中进行。
混合均匀： 加入酶液启动反应、加入TCA终止反应、加入显色试剂等关键步骤，需立即充分混匀。
沉淀完全： TCA加入后需保证足够的沉淀时间（10-20 min）和有效的离心（无沉淀悬浮），吸取上清液时务必小心，避免吸入沉淀。
显色条件： 福林酚显色受光照、温度、加样顺序影响。加入福林酚试剂后需立即混匀，显色过程避光，显色时间严格控制。
试剂质量： 使用符合要求的分析纯或更高纯度试剂。福林酚试剂、酪蛋白等关键试剂需注意批间差异，必要时重新标定。TCA溶液、碳酸钠溶液等可稳定储存一段时间，但福林酚试剂和酪蛋白溶液建议新鲜配制。
空白对照： 空白管必须包含除酶以外的所有试剂和步骤，用于消除背景干扰。其吸光度应很低。
平行实验： 建议每个样品做2-3个平行管，取平均值计算，以减小误差。

六、应用领域

该检测方法的结果主要用于：

产品质量控制： 监控生产的中性蛋白酶产品的活性是否符合规格要求。
工艺优化： 评估发酵条件、提取纯化工艺对酶活性的影响。
应用研究： 研究不同来源、不同处理条件下中性蛋白酶活性的变化，指导其在食品、洗涤剂、饲料等领域的应用参数。
酶学性质研究： 测定酶的最适pH、最适温度、热稳定性、pH稳定性、抑制剂/激活剂效应等。
标准化与比较： 为不同来源或批次的中性蛋白酶提供标准化的活性评价依据。

通过严格遵循上述步骤和注意事项，可以准确、可靠地测定中性蛋白酶的活性，为相关研究和应用提供关键数据支撑。