酸性蛋白酶活性检测方法
一、 引言
酸性蛋白酶（Acid Protease）是一类在酸性环境（pH 2.0-5.0）下具有最佳催化活性的蛋白酶，广泛存在于微生物（如黑曲霉、米曲霉）、植物（如菠萝、木瓜）以及动物胃液中。它们在水解蛋白质的肽键中发挥着关键作用，因此在食品工业（如啤酒澄清、面团改良、肉类嫩化）、饲料工业（提高蛋白质消化率）、皮革工业（脱毛软化）以及医药领域（如消化助剂）具有重要应用价值。准确测定酸性蛋白酶活性是评估其质量、优化生产工艺和应用效果的关键步骤。本方法基于蛋白酶水解酪蛋白释放酪氨酸的原理，并使用福林酚（Folin-Ciocalteu）试剂进行定量测定。
二、 检测原理
- 酶解反应： 在特定温度（通常37°C）和酸性pH（通常pH 3.0-4.0）条件下，酸性蛋白酶作用于底物酪蛋白（Casein），将其水解生成含有游离酚基（如酪氨酸、色氨酸）的短肽和氨基酸。
- 反应终止： 加入三氯乙酸（Trichloroacetic Acid, TCA）溶液终止酶反应，并使未水解的酪蛋白和较大分子多肽沉淀。
- 显色反应： 取含有可溶性酪氨酸（及含酚基物质）的上清液，加入碳酸钠（Na₂CO₃）溶液碱化环境，然后加入福林酚试剂。在碱性条件下，福林酚试剂与酪氨酸等含酚基物质发生反应，生成蓝色复合物。
- 比色定量： 该蓝色复合物在波长660 nm（或680 nm）处有最大光吸收。蓝色的深浅程度与样品中酪氨酸的含量（即蛋白酶水解产生的可溶性肽量）成正比。通过测定吸光度值，并与已知浓度的酪氨酸标准曲线进行比较，即可计算出样品中酸性蛋白酶的活性。
三、 试剂与材料
- 重要提示： 所有化学试剂均需使用分析纯等级试剂。实验用水建议使用去离子水或蒸馏水。
- 1. 底物溶液 (0.5% 酪蛋白溶液，pH 4.0)：
- 准确称取5.000g酪蛋白（Hammersten级或同等级别）。
- 加入少量预热至约40℃的0.1mol/L醋酸缓冲液（pH 4.0），在磁力搅拌器或水浴中缓慢加热并搅拌直至完全溶解（避免剧烈搅拌产生过多泡沫）。
- 冷却至室温，用0.1mol/L醋酸缓冲液（pH 4.0）定容至1000 mL。
- 该溶液在4℃冷藏条件下可稳定保存数天，使用前需恢复至37℃并确保无沉淀析出。若出现沉淀或浑浊，需重新配制。
- 2. 0.1mol/L 醋酸缓冲液 (pH 4.0)：
- 溶液A (0.2mol/L 醋酸钠溶液)： 称取27.22g三水合醋酸钠(NaCH₃COO·3H₂O)，溶解于水中，定容至1000mL。
- 溶液B (0.2mol/L 醋酸溶液)： 量取11.55mL冰醋酸，用水溶解并定容至1000mL。
- 配制pH 4.0缓冲液： 取溶液A 205mL与溶液B 795mL混合均匀。使用精密pH计校准，必要时用溶液A或溶液B微调pH至4.00±0.02。用水稀释至总浓度为0.1mol/L。
- 3. 三氯乙酸(TCA)溶液 (0.4mol/L)：
- 称取65.40g三氯乙酸，用水溶解并定容至1000 mL。室温储存。
- 4. 福林酚(Folin-Ciocalteu)试剂：
- 使用市售合格试剂或按标准方法配制。通常使用前用蒸馏水按说明书要求进行稀释（常用1:2或1:3稀释）。该试剂应储存于棕色瓶中，4℃冷藏避光保存。避免接触皮肤（具有强腐蚀性）。
- 5. 碳酸钠(Na₂CO₃)溶液 (0.4mol/L)：
- 称取42.40g无水碳酸钠(Na₂CO₃)，溶解于约800mL温水中，冷却后用水定容至1000mL。室温储存。
- 6. L-酪氨酸标准储备液 (1.0mg/mL或100μg/mL)：
- 准确称取100.0mg L-酪氨酸（预先在105℃干燥至恒重），置于小烧杯中。加入少量0.1mol/L盐酸(HCl)溶液（约40-50mL），加热（<50℃）溶解。冷却后，转移至100mL棕色容量瓶中，用0.1mol/L HCl溶液定容至刻度，混匀（此为1000μg/mL储备液）。4℃冷藏避光保存。
- 工作液： 临用前，用0.1mol/L HCl溶液稀释储备液至所需浓度（常用20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL）。
- 7. 酶稀释液：
- 通常使用配制底物溶液所用的0.1mol/L醋酸缓冲液(pH 4.0)或pH 4.0的缓冲盐水。用于将待测酶液稀释至适当浓度范围。
- 待测酶液：
- 将酸性蛋白酶样品用酶稀释液溶解并稀释，使预计的酶活性在标准曲线的线性范围内（通常需要预实验确定最佳稀释倍数）。
- 仪器设备：
- 精密分析天平
- pH计（精度±0.01）
- 恒温水浴锅（精度±0.1℃，37°C）
- 分光光度计（配备1cm光径比色皿）
- 计时器
- 移液器（精确移取不同体积，如0.1mL, 1.0mL, 2.0mL, 5.0mL等）
- 试管（如15mL具塞试管或离心管）
- 容量瓶（100mL, 1000mL等）
- 烧杯、量筒、玻璃棒等
- 离心机（如需离心去除沉淀）
- 定性滤纸或0.45μm/0.22μm微孔滤膜（如需过滤上清液）
四、 操作步骤
- 准备工作：
- 开启恒温水浴锅，设定温度至37±0.1°C。
- 将底物溶液(0.5%酪蛋白，pH 4.0)、0.4mol/L碳酸钠溶液、待测酶液及酶稀释液置于37°C水浴中预热至少15分钟。福林酚试剂和TCA溶液可在室温或水浴中平衡。
- 准备好试管并标记（空白管、样品管、标准管）。
- 酶解反应（37°C）：
- 取两支干净的试管（一支为空白管，一支为样品管）。
- 空白管： 加入1.0mL预热好的酶稀释液 + 1.0mL预热好的底物溶液。（先加酶稀释液，再加底物！此为关键）
- 样品管： 加入1.0mL预热好的待测酶液 + 1.0mL预热好的底物溶液。（先加酶液，再加底物！）
- 立即混匀（如涡旋振荡器或颠倒混匀），并同时启动计时器。
- 将两支试管精确置于37°C水浴中反应10分钟（反应时间可根据酶活力高低调整，如5-30分钟，需在报告中注明）。
- 终止反应：
- 反应10分钟结束时，立即向两支试管中各加入2.0mL预冷（或室温）的0.4mol/L TCA溶液（加入TCA即视为终止反应）。
- 剧烈振荡混匀。
- 将试管静置或室温放置10分钟，使未水解的酪蛋白充分沉淀。也可根据需要，在离心机中以3000-4000转/分钟离心10分钟，或用滤纸/滤膜过滤。
- 显色反应：
- 吸取反应终止并澄清后的上清液（或滤液）1.0mL（吸取时注意避免吸入沉淀），加入到另一支干净的试管中。
- 加入5.0mL 0.4mol/L碳酸钠(Na₂CO₃)溶液，混匀。
- 再加入1.0mL福林酚试剂（稀释好的），立即混匀（此步需快速完成）。
- 将此混合液置于37°C水浴（或室温，需保持一致）中显色20分钟。蓝色在此条件下达到稳定。
- 比色测定：
- 将显色后的溶液倒入1cm光径的比色皿中。
- 以空白管（按照上述步骤同样处理得到的澄清上清液）作为参比（调零）。
- 在分光光度计660nm（或680nm）波长下测定样品管溶液的吸光度(A₆₆₀)。
- 酪氨酸标准曲线制作：
- 分别吸取0.0mL (空白), 0.2mL, 0.4mL, 0.6mL, 0.8mL, 1.0mL的L-酪氨酸标准工作液（如100μg/mL），置于一组干净的试管中。
- 用0.1mol/L HCl溶液补足每管体积至1.0mL（即空白管加1.0mL盐酸溶液，其他管补加到1.0mL）。
- 向每支试管中加入：
- 1.0mL 酶稀释液（或水）
- 2.0mL 0.4mol/L TCA溶液
- 混匀（模拟酶解终止）。
- 吸取此混合液1.0mL（相当于吸取了标准液0μg, 20μg, 40μg, 60μg, 80μg, 100μg），加入到另一组干净的试管中。
- 加入5.0mL 0.4mol/L Na₂CO₃溶液，混匀。
- 加入1.0mL福林酚试剂，立即混匀。
- 置于37°C水浴（或室温）显色20分钟。
- 以不含酪氨酸的空白管调零，在660nm波长下测定各标准管的吸光度(A₆₆₀)。
- 以酪氨酸含量（μg）为横坐标(X)，对应的吸光度(A₆₆₀)为纵坐标(Y)，绘制标准曲线或进行线性回归（回归方程Y = aX + b， R²应>0.99）。
五、 结果计算
- 确定水解产物酪氨酸量：
- 将测得的样品吸光度(A₆₆₀样品)代入酪氨酸标准曲线回归方程Y = aX + b中，求出X值（单位：μg），该X值即为1.0mL上清液（来自样品管）中所含酪氨酸的量（反应10分钟产生的）。
- 注意： 此X值代表1.0mL上清液中所含的酪氨酸量（μg）。由于上清液是从总计4.0mL的反应终止混合液（1mL酶液/稀释液 + 1mL底物 + 2mL TCA）中吸取了1.0mL，并且这1.0mL上清液来源于含有1mL酶液的反应体系。因此，整个反应体系（含1mL酶液）在反应时间内水解酪蛋白产生的酪氨酸总量为：X (μg) * (4.0mL / 1.0mL) = 4X (μg)。
- 计算酶活性：
- 酶活力单位定义(U)： 在本测定条件下（pH 4.0, 37°C），每分钟水解酪蛋白产生1微克（μg）酪氨酸所需的酶量，定义为一个酸性蛋白酶活力单位（U）。
- 酶活力计算： 设：
A= 根据样品吸光度从标准曲线上查得的酪氨酸量（μg）（即1.0mL上清液中的量）n= 上清液总体积 / 吸取上清液体积（此处为4.0mL / 1.0mL = 4）t= 酶解反应时间（分钟）（此处为10分钟）V= 参与反应的酶液体积（mL）（此处为1.0mL）D= 待测酶液的稀释倍数（即原始酶液稀释了多少倍后得到的参与反应的酶液）
- 则，酶活性(U/mL) = (A * n) / (t * V) * D
- 代入本例数值：
酶活性(U/mL) = (A * 4) / (10 * 1) * D = (4A) / 10 * D = 0.4 * A * D - 结果表示： 报告每毫升（mL）原始酶液中所含的酶活力单位数（U/mL）。通常取三次重复测定的平均值作为最终结果。
六、 注意事项
- pH精确性： 缓冲液pH值和底物溶液的pH值必须精确控制在4.0±0.02范围内，这是酸性蛋白酶最适活性的关键。
- 温度控制： 酶解、显色反应均需在恒定温度（通常37°C）下进行，水浴温度波动应小于±0.1°C。
- 反应时间： 严格控制酶解反应时间（如10分钟），计时开始和结束（加TCA）动作要迅速、同步。
- 加样顺序： 空白管和样品管加样顺序必须严格按照“先加酶（或稀释液），后加底物”执行，否则空白值会异常升高。
- 混匀操作： 每一步加入试剂后均需充分混匀，但避免剧烈振荡产生过多泡沫。
- 沉淀去除： 加TCA后确保沉淀完全，上清液必须澄清透明才能用于显色。离心或过滤是常用的澄清方法。
- 显色稳定性： 福林酚显色反应完成后，蓝色在1-2小时内相对稳定，但仍建议在规定时间内完成比色测定。
- 福林酚试剂： 该试剂腐蚀性强，避免接触皮肤和衣物。稀释和使用时应小心操作。避光冷藏保存，注意有效期。
- 酶液浓度： 待测酶液浓度应调整到水解产物吸光度落在标准曲线的线性范围内（通常0.2-0.8吸光度单位）。过高需稀释，过低需浓缩或延长反应时间（需在计算式中体现）。
- 平行实验： 样品测定应设置2-3次重复，以减少误差。
- 安全： 实验操作中涉及的TCA、福林酚试剂等具有腐蚀性或毒性，需佩戴防护眼镜、手套，在通风良好处操作。
七、 应用与意义
本检测方法（福林酚法）是测定酸性蛋白酶活性的经典、可靠方法，被广泛采纳于相关国家标准、行业标准以及科研工作中。通过准确测定酸性蛋白酶活性：
- 质量控制： 可用于酶制剂生产企业对原料、中间品和成品的质量监控，确保产品符合规格要求。
- 工艺优化： 帮助研发和生产人员优化发酵条件、提取纯化工艺等，提高酶产率和活性。
- 应用研究： 评估酶在不同应用场景（如食品加工、饲料添加剂、皮革处理）中的实际功效和最佳使用条件。
- 比较评价： 为不同来源或批次的酸性蛋白酶产品间的性能比较提供客观依据。
准确可靠的酸性蛋白酶活性检测数据，对该酶的研发、生产、贸易和应用环节都具有重要的指导意义。