酸性蛋白酶活性检测方法
一、 引言
酸性蛋白酶(Acid Protease)是一类在酸性环境(pH 2.0-5.0)下具有最佳催化活性的蛋白酶,广泛存在于微生物(如黑曲霉、米曲霉)、植物(如菠萝、木瓜)以及动物胃液中。它们在水解蛋白质的肽键中发挥着关键作用,因此在食品工业(如啤酒澄清、面团改良、肉类嫩化)、饲料工业(提高蛋白质消化率)、皮革工业(脱毛软化)以及医药领域(如消化助剂)具有重要应用价值。准确测定酸性蛋白酶活性是评估其质量、优化生产工艺和应用效果的关键步骤。本方法基于蛋白酶水解酪蛋白释放酪氨酸的原理,并使用福林酚(Folin-Ciocalteu)试剂进行定量测定。
二、 检测原理
- 酶解反应: 在特定温度(通常37°C)和酸性pH(通常pH 3.0-4.0)条件下,酸性蛋白酶作用于底物酪蛋白(Casein),将其水解生成含有游离酚基(如酪氨酸、色氨酸)的短肽和氨基酸。
- 反应终止: 加入三氯乙酸(Trichloroacetic Acid, TCA)溶液终止酶反应,并使未水解的酪蛋白和较大分子多肽沉淀。
- 显色反应: 取含有可溶性酪氨酸(及含酚基物质)的上清液,加入碳酸钠(Na₂CO₃)溶液碱化环境,然后加入福林酚试剂。在碱性条件下,福林酚试剂与酪氨酸等含酚基物质发生反应,生成蓝色复合物。
- 比色定量: 该蓝色复合物在波长660 nm(或680 nm)处有最大光吸收。蓝色的深浅程度与样品中酪氨酸的含量(即蛋白酶水解产生的可溶性肽量)成正比。通过测定吸光度值,并与已知浓度的酪氨酸标准曲线进行比较,即可计算出样品中酸性蛋白酶的活性。
三、 试剂与材料
- 重要提示: 所有化学试剂均需使用分析纯等级试剂。实验用水建议使用去离子水或蒸馏水。
- 1. 底物溶液 (0.5% 酪蛋白溶液,pH 4.0):
- 准确称取5.000g酪蛋白(Hammersten级或同等级别)。
- 加入少量预热至约40℃的0.1mol/L醋酸缓冲液(pH 4.0),在磁力搅拌器或水浴中缓慢加热并搅拌直至完全溶解(避免剧烈搅拌产生过多泡沫)。
- 冷却至室温,用0.1mol/L醋酸缓冲液(pH 4.0)定容至1000 mL。
- 该溶液在4℃冷藏条件下可稳定保存数天,使用前需恢复至37℃并确保无沉淀析出。若出现沉淀或浑浊,需重新配制。
- 2. 0.1mol/L 醋酸缓冲液 (pH 4.0):
- 溶液A (0.2mol/L 醋酸钠溶液): 称取27.22g三水合醋酸钠(NaCH₃COO·3H₂O),溶解于水中,定容至1000mL。
- 溶液B (0.2mol/L 醋酸溶液): 量取11.55mL冰醋酸,用水溶解并定容至1000mL。
- 配制pH 4.0缓冲液: 取溶液A 205mL与溶液B 795mL混合均匀。使用精密pH计校准,必要时用溶液A或溶液B微调pH至4.00±0.02。用水稀释至总浓度为0.1mol/L。
- 3. 三氯乙酸(TCA)溶液 (0.4mol/L):
- 称取65.40g三氯乙酸,用水溶解并定容至1000 mL。室温储存。
- 4. 福林酚(Folin-Ciocalteu)试剂:
- 使用市售合格试剂或按标准方法配制。通常使用前用蒸馏水按说明书要求进行稀释(常用1:2或1:3稀释)。该试剂应储存于棕色瓶中,4℃冷藏避光保存。避免接触皮肤(具有强腐蚀性)。
- 5. 碳酸钠(Na₂CO₃)溶液 (0.4mol/L):
- 称取42.40g无水碳酸钠(Na₂CO₃),溶解于约800mL温水中,冷却后用水定容至1000mL。室温储存。
- 6. L-酪氨酸标准储备液 (1.0mg/mL或100μg/mL):
- 准确称取100.0mg L-酪氨酸(预先在105℃干燥至恒重),置于小烧杯中。加入少量0.1mol/L盐酸(HCl)溶液(约40-50mL),加热(<50℃)溶解。冷却后,转移至100mL棕色容量瓶中,用0.1mol/L HCl溶液定容至刻度,混匀(此为1000μg/mL储备液)。4℃冷藏避光保存。
- 工作液: 临用前,用0.1mol/L HCl溶液稀释储备液至所需浓度(常用20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL)。
- 7. 酶稀释液:
- 通常使用配制底物溶液所用的0.1mol/L醋酸缓冲液(pH 4.0)或pH 4.0的缓冲盐水。用于将待测酶液稀释至适当浓度范围。
- 待测酶液:
- 将酸性蛋白酶样品用酶稀释液溶解并稀释,使预计的酶活性在标准曲线的线性范围内(通常需要预实验确定最佳稀释倍数)。
- 仪器设备:
- 精密分析天平
- pH计(精度±0.01)
- 恒温水浴锅(精度±0.1℃,37°C)
- 分光光度计(配备1cm光径比色皿)
- 计时器
- 移液器(精确移取不同体积,如0.1mL, 1.0mL, 2.0mL, 5.0mL等)
- 试管(如15mL具塞试管或离心管)
- 容量瓶(100mL, 1000mL等)
- 烧杯、量筒、玻璃棒等
- 离心机(如需离心去除沉淀)
- 定性滤纸或0.45μm/0.22μm微孔滤膜(如需过滤上清液)
四、 操作步骤
- 准备工作:
- 开启恒温水浴锅,设定温度至37±0.1°C。
- 将底物溶液(0.5%酪蛋白,pH 4.0)、0.4mol/L碳酸钠溶液、待测酶液及酶稀释液置于37°C水浴中预热至少15分钟。福林酚试剂和TCA溶液可在室温或水浴中平衡。
- 准备好试管并标记(空白管、样品管、标准管)。
- 酶解反应(37°C):
- 取两支干净的试管(一支为空白管,一支为样品管)。
- 空白管: 加入1.0mL预热好的酶稀释液 + 1.0mL预热好的底物溶液。(先加酶稀释液,再加底物!此为关键)
- 样品管: 加入1.0mL预热好的待测酶液 + 1.0mL预热好的底物溶液。(先加酶液,再加底物!)
- 立即混匀(如涡旋振荡器或颠倒混匀),并同时启动计时器。
- 将两支试管精确置于37°C水浴中反应10分钟(反应时间可根据酶活力高低调整,如5-30分钟,需在报告中注明)。
- 终止反应:
- 反应10分钟结束时,立即向两支试管中各加入2.0mL预冷(或室温)的0.4mol/L TCA溶液(加入TCA即视为终止反应)。
- 剧烈振荡混匀。
- 将试管静置或室温放置10分钟,使未水解的酪蛋白充分沉淀。也可根据需要,在离心机中以3000-4000转/分钟离心10分钟,或用滤纸/滤膜过滤。
- 显色反应:
- 吸取反应终止并澄清后的上清液(或滤液)1.0mL(吸取时注意避免吸入沉淀),加入到另一支干净的试管中。
- 加入5.0mL 0.4mol/L碳酸钠(Na₂CO₃)溶液,混匀。
- 再加入1.0mL福林酚试剂(稀释好的),立即混匀(此步需快速完成)。
- 将此混合液置于37°C水浴(或室温,需保持一致)中显色20分钟。蓝色在此条件下达到稳定。
- 比色测定:
- 将显色后的溶液倒入1cm光径的比色皿中。
- 以空白管(按照上述步骤同样处理得到的澄清上清液)作为参比(调零)。
- 在分光光度计660nm(或680nm)波长下测定样品管溶液的吸光度(A₆₆₀)。
- 酪氨酸标准曲线制作:
- 分别吸取0.0mL (空白), 0.2mL, 0.4mL, 0.6mL, 0.8mL, 1.0mL的L-酪氨酸标准工作液(如100μg/mL),置于一组干净的试管中。
- 用0.1mol/L HCl溶液补足每管体积至1.0mL(即空白管加1.0mL盐酸溶液,其他管补加到1.0mL)。
- 向每支试管中加入:
- 1.0mL 酶稀释液(或水)
- 2.0mL 0.4mol/L TCA溶液
- 混匀(模拟酶解终止)。
- 吸取此混合液1.0mL(相当于吸取了标准液0μg, 20μg, 40μg, 60μg, 80μg, 100μg),加入到另一组干净的试管中。
- 加入5.0mL 0.4mol/L Na₂CO₃溶液,混匀。
- 加入1.0mL福林酚试剂,立即混匀。
- 置于37°C水浴(或室温)显色20分钟。
- 以不含酪氨酸的空白管调零,在660nm波长下测定各标准管的吸光度(A₆₆₀)。
- 以酪氨酸含量(μg)为横坐标(X),对应的吸光度(A₆₆₀)为纵坐标(Y),绘制标准曲线或进行线性回归(回归方程Y = aX + b, R²应>0.99)。
五、 结果计算
- 确定水解产物酪氨酸量:
- 将测得的样品吸光度(A₆₆₀样品)代入酪氨酸标准曲线回归方程Y = aX + b中,求出X值(单位:μg),该X值即为1.0mL上清液(来自样品管)中所含酪氨酸的量(反应10分钟产生的)。
- 注意: 此X值代表1.0mL上清液中所含的酪氨酸量(μg)。由于上清液是从总计4.0mL的反应终止混合液(1mL酶液/稀释液 + 1mL底物 + 2mL TCA)中吸取了1.0mL,并且这1.0mL上清液来源于含有1mL酶液的反应体系。因此,整个反应体系(含1mL酶液)在反应时间内水解酪蛋白产生的酪氨酸总量为:X (μg) * (4.0mL / 1.0mL) = 4X (μg)。
- 计算酶活性:
- 酶活力单位定义(U): 在本测定条件下(pH 4.0, 37°C),每分钟水解酪蛋白产生1微克(μg)酪氨酸所需的酶量,定义为一个酸性蛋白酶活力单位(U)。
- 酶活力计算: 设:
A
= 根据样品吸光度从标准曲线上查得的酪氨酸量(μg)(即1.0mL上清液中的量)n
= 上清液总体积 / 吸取上清液体积(此处为4.0mL / 1.0mL = 4)t
= 酶解反应时间(分钟)(此处为10分钟)V
= 参与反应的酶液体积(mL)(此处为1.0mL)D
= 待测酶液的稀释倍数(即原始酶液稀释了多少倍后得到的参与反应的酶液)
- 则,酶活性(U/mL) = (A * n) / (t * V) * D
- 代入本例数值:
酶活性(U/mL) = (A * 4) / (10 * 1) * D = (4A) / 10 * D = 0.4 * A * D
- 结果表示: 报告每毫升(mL)原始酶液中所含的酶活力单位数(U/mL)。通常取三次重复测定的平均值作为最终结果。
六、 注意事项
- pH精确性: 缓冲液pH值和底物溶液的pH值必须精确控制在4.0±0.02范围内,这是酸性蛋白酶最适活性的关键。
- 温度控制: 酶解、显色反应均需在恒定温度(通常37°C)下进行,水浴温度波动应小于±0.1°C。
- 反应时间: 严格控制酶解反应时间(如10分钟),计时开始和结束(加TCA)动作要迅速、同步。
- 加样顺序: 空白管和样品管加样顺序必须严格按照“先加酶(或稀释液),后加底物”执行,否则空白值会异常升高。
- 混匀操作: 每一步加入试剂后均需充分混匀,但避免剧烈振荡产生过多泡沫。
- 沉淀去除: 加TCA后确保沉淀完全,上清液必须澄清透明才能用于显色。离心或过滤是常用的澄清方法。
- 显色稳定性: 福林酚显色反应完成后,蓝色在1-2小时内相对稳定,但仍建议在规定时间内完成比色测定。
- 福林酚试剂: 该试剂腐蚀性强,避免接触皮肤和衣物。稀释和使用时应小心操作。避光冷藏保存,注意有效期。
- 酶液浓度: 待测酶液浓度应调整到水解产物吸光度落在标准曲线的线性范围内(通常0.2-0.8吸光度单位)。过高需稀释,过低需浓缩或延长反应时间(需在计算式中体现)。
- 平行实验: 样品测定应设置2-3次重复,以减少误差。
- 安全: 实验操作中涉及的TCA、福林酚试剂等具有腐蚀性或毒性,需佩戴防护眼镜、手套,在通风良好处操作。
七、 应用与意义
本检测方法(福林酚法)是测定酸性蛋白酶活性的经典、可靠方法,被广泛采纳于相关国家标准、行业标准以及科研工作中。通过准确测定酸性蛋白酶活性:
- 质量控制: 可用于酶制剂生产企业对原料、中间品和成品的质量监控,确保产品符合规格要求。
- 工艺优化: 帮助研发和生产人员优化发酵条件、提取纯化工艺等,提高酶产率和活性。
- 应用研究: 评估酶在不同应用场景(如食品加工、饲料添加剂、皮革处理)中的实际功效和最佳使用条件。
- 比较评价: 为不同来源或批次的酸性蛋白酶产品间的性能比较提供客观依据。
准确可靠的酸性蛋白酶活性检测数据,对该酶的研发、生产、贸易和应用环节都具有重要的指导意义。