碱性磷酸酶(AKP/ALP)活性检测

发布时间：2025-06-28 08:01:39 阅读量：1 作者：生物检测中心

碱性磷酸酶 (AKP/ALP) 活性检测原理与方法

一、 引言
碱性磷酸酶 (Alkaline Phosphatase, AKP 或 ALP， EC 3.1.3.1) 是一类在碱性环境下 (最适 pH 约为 9-10) 催化磷酸单酯水解生成无机磷酸和相应醇（或酚）的酶。广泛存在于人体各组织，尤其在肝脏、骨骼、肠道、肾脏、胎盘和白细胞中含量丰富。血清或血浆中 ALP 活性测定是临床常规生化检验项目之一，对于肝胆系统疾病（如阻塞性黄疸、肝炎）、骨骼疾病（如佝偻病、骨肿瘤、骨折愈合期）、甲状旁腺功能亢进等的诊断、鉴别诊断及病情监测具有重要意义。

二、 检测原理 (动力学法 - 以对硝基苯酚磷酸盐为底物)
目前最常用且推荐的检测方法是基于 对硝基苯酚磷酸盐 (p-Nitrophenyl Phosphate, pNPP) 作为底物的 连续监测法 (速率法)。其核心反应如下：

  1. 酶促反应：
    ALP 在碱性缓冲环境中，催化无色的底物对硝基苯酚磷酸盐 (pNPP) 水解：
    对硝基苯酚磷酸盐 (pNPP) + H₂O → 对硝基苯酚 (pNP) + 无机磷酸盐 (Pi)

  2. 显色反应：
    水解产物 对硝基苯酚 (p-nitrophenol, pNP) 在碱性条件下呈黄色。

  3. 定量检测：
    黄色产物对硝基苯酚 (pNP) 在 405 nm 波长附近有最大吸收峰。通过分光光度计在 405 nm 处连续监测反应过程中吸光度 (A) 随时间 (t) 的上升速率 (ΔA/min)。该吸光度的上升速率与样品中 ALP 的活性成正比。
    ALP 活性 ∝ ΔA₄₀₅nm / min

 

三、 主要试剂组分

  1. 缓冲液： 维持反应在碱性 pH (通常在 9.0 至 10.5 之间)，常用缓冲体系包括：
    • 二乙醇胺 (Diethanolamine, DEA) 缓冲液 (pH 约 9.8)
    • 2-氨基-2-甲基-1-丙醇 (2-Amino-2-methyl-1-propanol, AMP) 缓冲液 (pH 约 10.0 - 10.4)
    • 碳酸盐缓冲液 (pH 约 10.0)。缓冲液的选择会影响酶活性水平和同工酶反应性。
  2. 底物： 对硝基苯酚磷酸盐 (pNPP)，通常为二钠盐或二环己胺盐。溶解度高，稳定性好。
  3. 镁离子 (Mg²⁺)： 作为 ALP 的激活剂（辅因子），通常以氯化镁 (MgCl₂) 或硫酸镁 (MgSO₄) 形式提供，浓度需优化。
  4. 锌离子 (Zn²⁺)： 部分方法可能添加锌离子作为稳定剂或激活剂。
  5. 稳定剂/添加剂： 可能包含防腐剂、表面活性剂等以提高试剂稳定性和性能。
  6. 终止液 (仅终点法需要)： 强碱溶液 (如 NaOH)，用于终止反应并确保 pNP 完全显色。动力学法通常无需终止液。
 

四、 样品要求

  • 样本类型： 血清（首选）、肝素或 EDTA 抗凝血浆。避免溶血（红细胞含有 ALP）。
  • 样本采集： 按标准静脉采血程序进行。
  • 样本稳定性：
    • 室温 (20-25°C)： 数小时稳定。
    • 冷藏 (2-8°C)： 约 1 周稳定。
    • 冷冻 (-20°C)： 可稳定更长时间，但反复冻融可能导致活性下降。
  • 注意： 避免使用含有柠檬酸盐、草酸盐或氟化物的抗凝剂，它们可能抑制 ALP 活性。
 

五、 检测方法步骤 (以自动生化分析仪上的速率法为例)

  1. 试剂与样本准备： 按试剂说明书要求，将缓冲液、底物、激活剂等混合配制成工作液（或使用即用型试剂）。样本按要求稀释或不稀释。
  2. 加样与孵育：
    • 取一定体积 (如 20-50 µL) 的血清样本加入反应杯/比色皿。
    • 加入预热至反应温度 (通常为 37°C) 的工作试剂 (如 1.0 mL)。
    • 迅速混匀。
  3. 反应监测：
    • 将反应混合液置于恒温 (37°C) 的分光光度计或生化分析仪中。
    • 在 405 nm 波长处，连续监测吸光度 (A) 随时间的变化，监测一段时间 (如 60-180 秒)。
    • 仪器自动计算单位时间内吸光度的变化值 (ΔA/min)。
  4. 活性计算：
    • 根据朗伯-比尔定律和反应原理，ALP 活性 (U/L) 计算公式为：
      ALP 活性 = (ΔA/min 样品 - ΔA/min 空白) * (Vt * 1000) / (ε * d * Vs)
    • 其中：
      • ΔA/min 样品： 样品反应测得的吸光度变化率。
      • ΔA/min 空白： 试剂空白或样本空白测得的吸光度变化率（通常较小）。
      • Vt： 反应总体积 (mL)。
      • 1000： 将 mL 转换为 L 的系数。
      • ε： 对硝基苯酚 (pNP) 在 405 nm、所用反应液 pH 和温度下的摩尔吸光系数 (L·mol⁻¹·cm⁻¹)。 该值至关重要，需根据所用试剂体系精确确定（通常由试剂生产商优化并提供或在方法学评价中获得）。 常见值范围约为 18,500 - 18,750 L·mol⁻¹·cm⁻¹ (37°C, pH 10.0-10.4)，但必须验证确认。
      • d： 比色杯光径 (cm)，通常为 1 cm。
      • Vs： 样品体积 (mL)。
    • 现代自动生化分析仪已内置计算程序，用户只需输入正确的参数（如 ε 值、体积、光径），仪器会自动计算并报告结果。
 

六、 参考区间 (成人)

  • ALP 活性受年龄、性别、生理状态（如妊娠后期）、饮食等多种因素影响，不同实验室应建立自己的参考范围。
  • 常见参考范围：
    • 成人 (20-50岁)： 约 40 - 130 U/L (37°C，方法依赖)
    • 儿童及青少年： 显著高于成人，可达成人上限的 2-3 倍，与骨骼生长旺盛有关。
    • 老年人： 可能略高于年轻成人。
    • 孕妇 (尤其孕晚期)： 因胎盘型 ALP 升高，可达正常上限的 2-3 倍。
    • 注意： 参考范围差异很大，必须依据所使用的具体检测方法和试剂说明书或实验室验证确定的本地参考范围。
 

七、 临床意义

  1. 活性升高：
    • 肝胆系统疾病： 是 ALP 升高最常见的原因之一。
      • 胆汁淤积： 胆道梗阻（结石、肿瘤）、胆汁淤积性肝炎、原发性胆汁性胆管炎 (PBC)、原发性硬化性胆管炎 (PSC) 等。肝内外阻塞导致肝细胞合成 ALP 增加并反流入血。升高显著，常大于正常上限 4 倍。
      • 肝内占位性病变： 肝癌（特别是胆管细胞癌）、肝脓肿、肝转移癌等。
      • 肝细胞损伤： 肝炎、肝硬化等也可有轻中度升高，但通常不如 ALT/AST 升高显著。
    • 骨骼疾病： 成骨细胞活动增强导致骨型 ALP 释放入血。
      • 代谢性骨病： 佝偻病、骨软化症。
      • 骨肿瘤： 骨肉瘤、骨转移癌（尤其是成骨性转移，如前列腺癌）。
      • 骨折愈合期。
      • 甲状旁腺功能亢进症。
      • Paget's 骨病。
    • 其他：
      • 生理性：儿童生长期、妊娠后期（胎盘型）。
      • 肠道疾病（如溃疡性结肠炎活动期、肠道感染等，肠型 ALP）。
      • 肾脏疾病（慢性肾功能不全等）。
      • 某些药物影响（如苯妥英钠、巴比妥类）。
  2. 活性降低： 较少见，临床意义相对较小。
    • 严重慢性肾炎。
    • 甲状腺功能减退症。
    • 恶性贫血。
    • 先天性低磷酸酶血症（罕见遗传病）。
    • 重度营养不良。
    • 大量输血（输入枸橼酸钠抗凝血）。
    • 某些药物（如硫唑嘌呤）。
 

八、 注意事项与质量控制

  1. 干扰因素：
    • 溶血： 红细胞含有 ALP，严重溶血会导致结果假性升高。
    • 脂血： 重度脂血可能影响吸光度测定，需采用适当措施（如高速离心去除脂质）。
    • 黄疸： 胆红素在 405-460 nm 有吸收，可能干扰测定（正干扰）。现代方法通过双波长测定或试剂优化可减少干扰。
    • 药物： 某些药物可能诱导或抑制 ALP（如雌激素、别嘌呤醇、氯丙嗪、硫唑嘌呤等）。
    • 标本放置时间过长或在较高温度下储存可能导致活性降低。
    • 抗凝剂： 避免使用柠檬酸盐、草酸盐、氟化物等抗凝剂。
  2. 方法学考虑：
    • 摩尔吸光系数 (ε)： 必须使用针对特定试剂系统和反应条件（温度、pH、缓冲液）验证过的 ε 值，这是结果准确的关键因素。
    • 线性范围： 确保待测样本的 ALP 活性在方法的线性范围内。超出线性需稀释后重测（稀释方法需验证）。
    • 温度： 严格控制反应温度 (通常 37°C ± 0.1°C)。
    • 空白： 试剂空白和必要时样本空白（如高度黄疸、溶血样本）的准确设置至关重要。
  3. 质量控制：
    • 室内质控 (IQC)： 每批次检测都应包含至少两个水平（正常值和病理值）的质控品，应用 Levey-Jennings 图等监控检测过程的精密度和准确度，判断结果是否在控。
    • 室间质评 (EQA)： 定期参加权威机构组织的室间质量评价活动，评估实验室间结果的可比性和准确性。
  4. 同工酶检测： 当总 ALP 升高来源不明时，可通过电泳、热灭活、化学抑制、特异性免疫测定等方法区分肝型、骨型、肠型、胎盘型等同工酶，辅助临床鉴别诊断（如鉴别肝胆疾病与骨骼疾病）。
 

九、 总结
碱性磷酸酶活性检测是临床生化实验室常规且重要的项目。基于对硝基苯酚磷酸盐底物的连续监测法（速率法）因其简便、快速、准确、自动化程度高而被广泛采用。理解其检测原理、标准化操作流程、样本要求、干扰因素以及严格的质量控制是获得可靠结果的基础。结合临床信息（如年龄、性别、病史、其他肝功能指标、影像学检查等），血清 ALP 活性测定为肝胆系统疾病和骨骼疾病的诊断与监测提供了重要的实验室依据。

参考文献 (示例 - 需根据实际使用的方法溯源)

  • International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (IFCC) methods documents (if applicable to the specific buffer system used).
  • Tietz Textbook of Clinical Chemistry and Molecular Diagnostics. Nader Rifai, et al. (Eds.).
  • 试剂制造商提供的详细说明书（用户操作手册）。
  • 中华人民共和国卫生行业标准 - 临床生物化学检验常规项目分析质量指标等。