植物总酚(Tp)含量检测

发布时间：2025-06-27 18:36:33 阅读量：3 作者：生物检测中心

植物总酚含量测定方法详解：福林酚比色法

引言
植物总酚（Total Phenolics, Tp）是一类广泛存在于植物组织中的重要次生代谢产物，具有显著的抗氧化、抗菌、抗炎等生物活性。其含量是评价植物资源品质、生理状态及加工潜力的关键指标。福林酚（Folin-Ciocalteu）比色法因其灵敏度高、操作简便、重现性好，成为测定植物总酚含量的标准方法。

一、 测定原理
福林酚试剂在碱性条件下不稳定，易被酚类化合物还原，生成蓝色的钨蓝和钼蓝复合物（最大吸收波长通常在 765 nm 附近）。蓝色的深浅与参与反应的酚羟基数量成正比关系。通过与标准品（常用没食子酸）建立的浓度-吸光度标准曲线进行比较，即可定量计算出样品中总酚的含量，结果常以没食子酸当量（Galllic Acid Equivalent, GAE）表示。

二、 仪器与试剂

  • 主要仪器：

    • 紫外-可见分光光度计
    • 分析天平（精度 0.0001 g）
    • 离心机（可达 4000 rpm 以上）
    • 恒温水浴锅（或可控温干燥箱）
    • 涡旋振荡器
    • 超声波清洗器（可选，用于辅助提取）
    • pH 计
    • 移液枪（单道、多道）
    • 容量瓶（10 mL, 25 mL, 50 mL, 100 mL）
    • 具塞试管或离心管（10 mL, 15 mL）
    • 比色皿（光程 1 cm）

  • 主要试剂：

    • 没食子酸标准品： 纯度 ≥ 98% (HPLC)。
    • 福林酚试剂： 分析纯。
    • 碳酸钠溶液（20%， w/v）： 称取 200 g 无水碳酸钠（分析纯），用蒸馏水溶解并定容至 1000 mL。
    • 提取溶剂：
      • 常用 甲醇-水溶液（如 70% 甲醇）：700 mL 甲醇（色谱纯）加入 300 mL 蒸馏水。
      • 或 乙醇-水溶液（如 50-80% 乙醇）。
      • （选择依据：目标酚类物质溶解性及后续应用要求）。
    • 蒸馏水或去离子水： 符合实验室二级水标准。
    • 盐酸溶液（1 M）： 用于调节提取液 pH（有时需要）。
    • 抗坏血酸溶液（1%， w/v）： 用于部分易氧化样品的提取（可选）。
 

三、 实验步骤

  1. 样品制备：

    • 新鲜植物样品：快速清洗、擦干，必要时分割（如叶片去脉、果实去核）。液氮速冻，用研钵或组织研磨仪充分研磨成细粉，混匀。
    • 干燥植物样品：粉碎（研磨仪或粉碎机），过 40-60 目筛，混匀。

  2. 酚类物质提取：

    • 准确称取一定量（W，精确至 0.0001 g，通常 0.1-0.5 g）样品粉末于具塞试管或离心管中。
    • 加入适量提取溶剂（V<sub>extract</sub>，通常 10-20 mL），确保溶剂完全浸没样品。
    • 剧烈涡旋振荡 1-2 分钟，使样品充分浸润。
    • 提取方式选择：
      • 超声辅助提取（常用）： 将试管置于超声波清洗仪水浴中，室温下超声提取 20-40 分钟（功率、时间需根据样品优化）。
      • 振荡提取： 置于恒温振荡器中，避光条件下振荡提取 30-60 分钟（温度、转速需优化）。
      • 热回流提取（用于难溶物质）： 在恒温水浴锅或索氏提取器中加热回流。
    • 提取结束后，将提取液 4000 rpm 离心 10-15 分钟。
    • 小心吸取上清液至另一干净容器中。必要时，可将沉淀物用少量提取溶剂洗涤并再次离心，合并上清液。
    • 用提取溶剂将合并的上清液定容至一定体积（V<sub>total</sub>，如 25 mL 或 50 mL），此为 样品提取液。对于颜色深或预期酚含量高的样品，可根据初步试验结果进行适当稀释（标记稀释倍数 D）。提取液若不能立即测定，应避光冷藏（4°C）保存，尽快分析。

  3. 没食子酸标准曲线绘制：

    • 储备液： 准确称取 50.0 mg 没食子酸标准品于 50 mL 容量瓶中，用提取溶剂溶解并定容至刻度，摇匀。此储备液浓度为 1 mg/mL (1000 μg/mL)。
    • 系列标准工作液： 分别吸取适量储备液（如 0, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5 mL）于 10 mL 容量瓶中（或具塞试管中），用提取溶剂定容至刻度（或加入提取溶剂至 10 mL），得到浓度分别为 0, 50, 100, 150, 200, 250 μg/mL 的没食子酸标准溶液系列。推荐至少 5 个浓度点（含零点）。

  4. 显色反应（避光操作！）：

    • 取数支干燥洁净的具塞试管（如 10 mL 或 15 mL），按以下步骤操作（每个样品/标准点建议做平行）：
      • 空白管： 加入 0.5 mL 蒸馏水 + 0.5 mL 提取溶剂。
      • 样品管： 加入 0.5 mL 蒸馏水 + 0.5 mL 样品提取液（或适当稀释后的提取液）。
      • 标准管： 加入 0.5 mL 蒸馏水 + 0.5 mL 没食子酸标准工作液。
    • 向上述各管中准确加入 2.5 mL 福林酚试剂（使用前按说明书要求稀释或直接用原液，确保所有管使用同一批次稀释液）。立即涡旋混匀。
    • 静置 5-8 分钟（时间需严格控制一致）。
    • 向各管中加入 2.0 mL 20% 碳酸钠溶液。立刻涡旋振荡充分混匀。
    • 避光条件下，于室温（通常 25±2°C）放置 60-90 分钟（时间需严格控制一致）进行显色反应。

  5. 吸光度测定：

    • 显色反应结束后，将反应液转移至 1 cm 光程的比色皿中。
    • 以 空白管 反应液作为参比溶液（调零）。
    • 在 765 nm 波长处测定 标准管 和 样品管 反应液的吸光度（A）。若反应液浑浊，需离心澄清后再测定。
 

四、 结果计算

  1. 绘制标准曲线：

    • 以没食子酸标准溶液的浓度（C<sub>std</sub>, μg/mL）为横坐标（X），测得的吸光度值（A<sub>std</sub>）为纵坐标（Y），绘制标准曲线。一般采用线性回归得到标准曲线方程：A = k × C + b （其中 k 为斜率，b 为截距，通常要求相关系数 R² ≥ 0.999）。

  2. 计算样品总酚含量：

    • 将样品管测得的吸光度值（A<sub>sample</sub>）代入标准曲线方程，计算出样品提取液在比色体系中所对应的 没食子酸当量浓度（C<sub>eq</sub>, μg/mL）。
    • 计算样品中总酚含量（Tp）：
      Tp (mg GAE / g 样品) = (C<sub>eq</sub> × V<sub>total</sub> × D) / (W × 1000)
    • 式中：
      • Tp： 植物样品中总酚含量，单位为 毫克没食子酸当量每克样品 (mg GAE/g)。
      • C<sub>eq</sub>： 由标准曲线计算得到的样品提取液中总酚浓度（以没食子酸当量计），单位为 微克每毫升 (μg/mL)。
      • V<sub>total</sub>： 样品提取液的总定容体积，单位为 毫升 (mL)。
      • D： 测定前样品提取液的稀释倍数（若未稀释，则 D = 1）。
      • W： 用于提取的植物样品质量，单位为 克 (g)。
      • 1000： 单位换算系数（μg 换算成 mg）。
 

五、 注意事项与说明

  1. 关键因素控制：

    • 避光与避氧： 酚类易氧化，福林酚试剂见光不稳定。整个实验过程（尤其是提取、显色及存放）应尽量避光、快速操作。提取时可考虑加入少量抗坏血酸（如1%）防止氧化。
    • pH 值： 显色反应的 pH 必须为碱性（碳酸钠提供）。确保碳酸钠溶液浓度准确且新鲜配制（久置可能吸收 CO<sub>2</sub> 降低碱性）。
    • 反应时间与温度： 加入福林酚后的静置时间、加入碳酸钠后的显色时间及反应温度必须严格一致，对显色强度和稳定性影响显著。建议在同一批次内完成所有样品测定。
    • 加样顺序与混匀： 严格按照“水/溶剂 → 福林酚 →（静置）→ 碳酸钠”的顺序加入试剂，且每次加液后必须立即充分混匀。加入碳酸钠后会迅速释放热量并产生 CO<sub>2</sub>，需快速混匀避免局部过热或不均。

  2. 干扰物质：

    • 福林酚试剂不仅与酚羟基反应，也能还原一些非酚类还原性物质（如抗坏血酸、还原糖、某些氨基酸、亚硫酸盐、某些金属离子如 Fe²⁺、Cu⁺等）。应尽量选择不含或低含这些物质的提取溶剂（如甲醇优于丙酮）。样品中若富含此类物质，结果可能偏高。文献中常用甲醇或乙醇水溶液，部分干扰相对较轻。
    • 蛋白质、多糖等大分子物质可能导致溶液浑浊，干扰吸光度测定（表现为背景值升高或沉淀）。离心是去除浑浊的有效手段。高色素样品可能干扰比色，需通过稀释或在特定波长下校正背景（难度较大）。

  3. 方法优化与验证：

    • 提取条件： 对于新材料，需优化提取溶剂（浓度、种类）、料液比、提取时间、温度、次数等，以达到最佳提取效率。可通过单因素或正交试验摸索。
    • 显色条件： 标准方法中显色时间为60-90分钟（765 nm测定），部分文献报道在750 nm测定时显色40分钟可能已达平台。建议根据自身仪器和条件，通过时间曲线确定合适的测定波长和显色时间。
    • 标准曲线范围： 确保样品吸光度落在标准曲线的线性范围内（通常吸光度在0.2-0.8之间线性较好）。过高浓度需稀释。
    • 精密度与加标回收率： 实验中应设置平行样（通常n≥3），计算相对标准偏差（RSD%）以评估精密度（一般要求 RSD% < 5%）。进行加标回收实验（向已知样品中加入一定量没食子酸标准品）以评估方法准确度（回收率一般要求在90-110%之间）。

  4. 结果表示：

    • 结果应明确表示为 “总酚含量：X.XX ± Y.YY mg GAE/g”（干重或鲜重），注明是以干物质（Dry Weight, DW）还是鲜物质（Fresh Weight, FW）计重。
    • 鲜重/干重换算： 若样品以鲜重称量，但需报告干重结果（常见于不同样品间比较），需另测定样品含水率：干重含量 = 鲜重含量 × (100% / (100% - 含水率%))。
    • 报告中需包含标准曲线方程及其相关系数（R²）。
 

结论
福林酚比色法是测定植物总酚含量的可靠且广泛应用的方法。通过严格控制提取效率、优化显色条件、排除干扰因素并进行充分的方法验证，可获得准确、可重复的分析结果，为评价植物资源品质、研究植物生理代谢提供重要数据支撑。

参考文献（示例格式）

  • Singleton, V. L., Orthofer, R., & Lamuela-Raventós, R. M. (1999). Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of folin-ciocalteu reagent. Methods in Enzymology, 299, 152-178. (经典原始方法)
  • Waterhouse, A. L. (2002). Determination of total phenolics. Current Protocols in Food Analytical Chemistry, 6(1), I1.1.1-I1.1.8. (标准操作流程)
  • (可根据研究对象引用领域内应用该方法的具体文献)