植物总酚(Tp)含量检测

发布时间:2025-06-27 18:36:33 阅读量:2 作者:生物检测中心

植物总酚含量测定方法详解:福林酚比色法

引言
植物总酚(Total Phenolics, Tp)是一类广泛存在于植物组织中的重要次生代谢产物,具有显著的抗氧化、抗菌、抗炎等生物活性。其含量是评价植物资源品质、生理状态及加工潜力的关键指标。福林酚(Folin-Ciocalteu)比色法因其灵敏度高、操作简便、重现性好,成为测定植物总酚含量的标准方法。

一、 测定原理
福林酚试剂在碱性条件下不稳定,易被酚类化合物还原,生成蓝色的钨蓝和钼蓝复合物(最大吸收波长通常在 765 nm 附近)。蓝色的深浅与参与反应的酚羟基数量成正比关系。通过与标准品(常用没食子酸)建立的浓度-吸光度标准曲线进行比较,即可定量计算出样品中总酚的含量,结果常以没食子酸当量(Galllic Acid Equivalent, GAE)表示。

二、 仪器与试剂

  • 主要仪器:

    • 紫外-可见分光光度计
    • 分析天平(精度 0.0001 g)
    • 离心机(可达 4000 rpm 以上)
    • 恒温水浴锅(或可控温干燥箱)
    • 涡旋振荡器
    • 超声波清洗器(可选,用于辅助提取)
    • pH 计
    • 移液枪(单道、多道)
    • 容量瓶(10 mL, 25 mL, 50 mL, 100 mL)
    • 具塞试管或离心管(10 mL, 15 mL)
    • 比色皿(光程 1 cm)
  • 主要试剂:

    • 没食子酸标准品: 纯度 ≥ 98% (HPLC)。
    • 福林酚试剂: 分析纯。
    • 碳酸钠溶液(20%, w/v): 称取 200 g 无水碳酸钠(分析纯),用蒸馏水溶解并定容至 1000 mL。
    • 提取溶剂:
      • 常用 甲醇-水溶液(如 70% 甲醇):700 mL 甲醇(色谱纯)加入 300 mL 蒸馏水。
      • 乙醇-水溶液(如 50-80% 乙醇)。
      • 选择依据:目标酚类物质溶解性及后续应用要求)。
    • 蒸馏水或去离子水: 符合实验室二级水标准。
    • 盐酸溶液(1 M): 用于调节提取液 pH(有时需要)。
    • 抗坏血酸溶液(1%, w/v): 用于部分易氧化样品的提取(可选)。
 

三、 实验步骤

  1. 样品制备:

    • 新鲜植物样品:快速清洗、擦干,必要时分割(如叶片去脉、果实去核)。液氮速冻,用研钵或组织研磨仪充分研磨成细粉,混匀。
    • 干燥植物样品:粉碎(研磨仪或粉碎机),过 40-60 目筛,混匀。
  2. 酚类物质提取:

    • 准确称取一定量(W,精确至 0.0001 g,通常 0.1-0.5 g)样品粉末于具塞试管或离心管中。
    • 加入适量提取溶剂(V<sub>extract</sub>,通常 10-20 mL),确保溶剂完全浸没样品。
    • 剧烈涡旋振荡 1-2 分钟,使样品充分浸润。
    • 提取方式选择:
      • 超声辅助提取(常用): 将试管置于超声波清洗仪水浴中,室温下超声提取 20-40 分钟(功率、时间需根据样品优化)。
      • 振荡提取: 置于恒温振荡器中,避光条件下振荡提取 30-60 分钟(温度、转速需优化)。
      • 热回流提取(用于难溶物质): 在恒温水浴锅或索氏提取器中加热回流。
    • 提取结束后,将提取液 4000 rpm 离心 10-15 分钟
    • 小心吸取上清液至另一干净容器中。必要时,可将沉淀物用少量提取溶剂洗涤并再次离心,合并上清液。
    • 用提取溶剂将合并的上清液定容至一定体积(V<sub>total</sub>,如 25 mL 或 50 mL),此为 样品提取液。对于颜色深或预期酚含量高的样品,可根据初步试验结果进行适当稀释(标记稀释倍数 D)。提取液若不能立即测定,应避光冷藏(4°C)保存,尽快分析。
  3. 没食子酸标准曲线绘制:

    • 储备液: 准确称取 50.0 mg 没食子酸标准品于 50 mL 容量瓶中,用提取溶剂溶解并定容至刻度,摇匀。此储备液浓度为 1 mg/mL (1000 μg/mL)。
    • 系列标准工作液: 分别吸取适量储备液(如 0, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5 mL)于 10 mL 容量瓶中(或具塞试管中),用提取溶剂定容至刻度(或加入提取溶剂至 10 mL),得到浓度分别为 0, 50, 100, 150, 200, 250 μg/mL 的没食子酸标准溶液系列。推荐至少 5 个浓度点(含零点)。
  4. 显色反应(避光操作!):

    • 取数支干燥洁净的具塞试管(如 10 mL 或 15 mL),按以下步骤操作(每个样品/标准点建议做平行):
      • 空白管: 加入 0.5 mL 蒸馏水 + 0.5 mL 提取溶剂。
      • 样品管: 加入 0.5 mL 蒸馏水 + 0.5 mL 样品提取液(或适当稀释后的提取液)。
      • 标准管: 加入 0.5 mL 蒸馏水 + 0.5 mL 没食子酸标准工作液
    • 向上述各管中准确加入 2.5 mL 福林酚试剂(使用前按说明书要求稀释或直接用原液,确保所有管使用同一批次稀释液)。立即涡旋混匀。
    • 静置 5-8 分钟(时间需严格控制一致)。
    • 向各管中加入 2.0 mL 20% 碳酸钠溶液。立刻涡旋振荡充分混匀。
    • 避光条件下,于室温(通常 25±2°C)放置 60-90 分钟(时间需严格控制一致)进行显色反应。
  5. 吸光度测定:

    • 显色反应结束后,将反应液转移至 1 cm 光程的比色皿中。
    • 空白管 反应液作为参比溶液(调零)。
    • 765 nm 波长处测定 标准管样品管 反应液的吸光度(A)。若反应液浑浊,需离心澄清后再测定。
 

四、 结果计算

  1. 绘制标准曲线:

    • 以没食子酸标准溶液的浓度(C<sub>std</sub>, μg/mL)为横坐标(X),测得的吸光度值(A<sub>std</sub>)为纵坐标(Y),绘制标准曲线。一般采用线性回归得到标准曲线方程:A = k × C + b (其中 k 为斜率,b 为截距,通常要求相关系数 R² ≥ 0.999)。
  2. 计算样品总酚含量:

    • 将样品管测得的吸光度值(A<sub>sample</sub>)代入标准曲线方程,计算出样品提取液在比色体系中所对应的 没食子酸当量浓度(C<sub>eq</sub>, μg/mL)。
    • 计算样品中总酚含量(Tp):
      Tp (mg GAE / g 样品) = (C<sub>eq</sub> × V<sub>total</sub> × D) / (W × 1000)
    • 式中:
      • Tp: 植物样品中总酚含量,单位为 毫克没食子酸当量每克样品 (mg GAE/g)
      • C<sub>eq</sub>: 由标准曲线计算得到的样品提取液中总酚浓度(以没食子酸当量计),单位为 微克每毫升 (μg/mL)
      • V<sub>total</sub>: 样品提取液的总定容体积,单位为 毫升 (mL)
      • D: 测定前样品提取液的稀释倍数(若未稀释,则 D = 1)。
      • W: 用于提取的植物样品质量,单位为 克 (g)
      • 1000: 单位换算系数(μg 换算成 mg)。
 

五、 注意事项与说明

  1. 关键因素控制:

    • 避光与避氧: 酚类易氧化,福林酚试剂见光不稳定。整个实验过程(尤其是提取、显色及存放)应尽量避光、快速操作。提取时可考虑加入少量抗坏血酸(如1%)防止氧化。
    • pH 值: 显色反应的 pH 必须为碱性(碳酸钠提供)。确保碳酸钠溶液浓度准确且新鲜配制(久置可能吸收 CO<sub>2</sub> 降低碱性)。
    • 反应时间与温度: 加入福林酚后的静置时间、加入碳酸钠后的显色时间及反应温度必须严格一致,对显色强度和稳定性影响显著。建议在同一批次内完成所有样品测定。
    • 加样顺序与混匀: 严格按照“水/溶剂 → 福林酚 →(静置)→ 碳酸钠”的顺序加入试剂,且每次加液后必须立即充分混匀。加入碳酸钠后会迅速释放热量并产生 CO<sub>2</sub>,需快速混匀避免局部过热或不均。
  2. 干扰物质:

    • 福林酚试剂不仅与酚羟基反应,也能还原一些非酚类还原性物质(如抗坏血酸、还原糖、某些氨基酸、亚硫酸盐、某些金属离子如 Fe²⁺、Cu⁺等)。应尽量选择不含或低含这些物质的提取溶剂(如甲醇优于丙酮)。样品中若富含此类物质,结果可能偏高。文献中常用甲醇或乙醇水溶液,部分干扰相对较轻。
    • 蛋白质、多糖等大分子物质可能导致溶液浑浊,干扰吸光度测定(表现为背景值升高或沉淀)。离心是去除浑浊的有效手段。高色素样品可能干扰比色,需通过稀释或在特定波长下校正背景(难度较大)。
  3. 方法优化与验证:

    • 提取条件: 对于新材料,需优化提取溶剂(浓度、种类)、料液比、提取时间、温度、次数等,以达到最佳提取效率。可通过单因素或正交试验摸索。
    • 显色条件: 标准方法中显色时间为60-90分钟(765 nm测定),部分文献报道在750 nm测定时显色40分钟可能已达平台。建议根据自身仪器和条件,通过时间曲线确定合适的测定波长和显色时间。
    • 标准曲线范围: 确保样品吸光度落在标准曲线的线性范围内(通常吸光度在0.2-0.8之间线性较好)。过高浓度需稀释。
    • 精密度与加标回收率: 实验中应设置平行样(通常n≥3),计算相对标准偏差(RSD%)以评估精密度(一般要求 RSD% < 5%)。进行加标回收实验(向已知样品中加入一定量没食子酸标准品)以评估方法准确度(回收率一般要求在90-110%之间)。
  4. 结果表示:

    • 结果应明确表示为 “总酚含量:X.XX ± Y.YY mg GAE/g”(干重或鲜重),注明是以干物质(Dry Weight, DW)还是鲜物质(Fresh Weight, FW)计重。
    • 鲜重/干重换算: 若样品以鲜重称量,但需报告干重结果(常见于不同样品间比较),需另测定样品含水率:干重含量 = 鲜重含量 × (100% / (100% - 含水率%))
    • 报告中需包含标准曲线方程及其相关系数(R²)。
 

结论
福林酚比色法是测定植物总酚含量的可靠且广泛应用的方法。通过严格控制提取效率、优化显色条件、排除干扰因素并进行充分的方法验证,可获得准确、可重复的分析结果,为评价植物资源品质、研究植物生理代谢提供重要数据支撑。

参考文献(示例格式)

  • Singleton, V. L., Orthofer, R., & Lamuela-Raventós, R. M. (1999). Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of folin-ciocalteu reagent. Methods in Enzymology, 299, 152-178. (经典原始方法)
  • Waterhouse, A. L. (2002). Determination of total phenolics. Current Protocols in Food Analytical Chemistry, 6(1), I1.1.1-I1.1.8. (标准操作流程)
  • (可根据研究对象引用领域内应用该方法的具体文献)