羟自由基清除能力检测方法
一、引言
羟自由基（·OH）是活性氧（ROS）家族中最具破坏性的成员之一。其氧化能力极强（氧化还原电位高达2.8V），几乎能与所有生物分子（如蛋白质、脂质、DNA）发生无差别攻击，引发氧化损伤，与衰老、癌症、神经退行性疾病等多种病理过程密切相关。因此，评估物质（特别是天然及合成抗氧化剂）清除羟自由基的能力，对评价其潜在的健康益处或抗氧化效能具有重要意义。Fenton反应体系及邻二氮菲-Fe²⁺氧化法是体外评价羟自由基清除能力的常用方法。
二、检测原理
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羟自由基产生： 该方法基于经典的Fenton反应产生羟自由基：
Fe²⁺ + H₂O₂ → Fe³⁺ + ·OH + OH⁻
溶液中存在的Fe²⁺与H₂O₂反应，高效生成具有高度反应活性的·OH。 -
自由基攻击与显色反应：
- 在邻二氮菲-Fe²⁺体系中，橙红色络合物邻二氮菲-Fe²⁺（在536 nm附近有最大吸收峰）会被体系中产生的羟自由基优先攻击破坏。
- 攻击导致Fe²⁺被氧化成Fe³⁺，络合物随之解离，溶液颜色由橙红色逐渐褪为淡黄色或无色，在536 nm处的吸光度（A₅₃₆）显著下降。
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抗氧化剂的作用： 当加入具有羟自由基清除能力的待测样品时：
- 样品中的活性成分能竞争性地与体系产生的羟自由基反应，清除或淬灭部分羟自由基。
- 被清除的羟自由基无法再攻击和破坏邻二氮菲-Fe²⁺络合物。
- 因此，与未加样品的损伤对照组相比，加入样品的体系中剩余的邻二氮菲-Fe²⁺络合物更多，溶液颜色更深，测得的A₅₃₆值也更高。
三、主要试剂与材料
- 邻二氮菲溶液（7.5 mmol/L）： 准确称取邻二氮菲一水合物，用无水乙醇溶解定容。
- 磷酸盐缓冲液（PBS, 0.2 mol/L, pH 7.4）： 准确配制所需pH的磷酸盐缓冲液（通常pH 7.4模拟生理环境）。
- 硫酸亚铁溶液（7.5 mmol/L）： 临用前准确称取FeSO₄·7H₂O，用蒸馏水溶解定容（新鲜配制）。
- 过氧化氢溶液（0.1% v/v）： 用蒸馏水稀释30% H₂O₂母液至所需浓度。
- 待测样品溶液： 将样品溶解于适当的溶剂（如水、缓冲液、乙醇等，需确保溶剂本身对体系无显著干扰），通常配制成一系列浓度梯度。
- 阳性对照： 常用抗坏血酸（维生素C）、甘露醇、硫脲等已知强羟自由基清除剂作为阳性对照。
- 蒸馏水或去离子水
- 无水乙醇
- 常用实验室设备： 紫外-可见分光光度计、恒温水浴锅、精密天平、pH计、微量移液器、离心机、离心管、试管、比色皿（玻璃或石英）、容量瓶、烧杯等。
四、操作步骤（邻二氮菲-Fe²⁺氧化法）
- 溶液配制： 按要求准确配制上述所有试剂。
- 空白对照组：
- 取一支试管，依次加入：
- 1.0 mL PBS (0.2 mol/L, pH 7.4)
- 1.0 mL 邻二氮菲溶液 (7.5 mmol/L)
- 1.0 mL 蒸馏水 (代替H₂O₂和Fe²⁺)
- 混匀，室温放置10分钟。
- 用分光光度计在536 nm波长处测定吸光度，记为A<sub>空白</sub>。
- 取一支试管，依次加入：
- 损伤对照组：
- 取一支试管，依次加入：
- 1.0 mL PBS (0.2 mol/L, pH 7.4)
- 1.0 mL 邻二氮菲溶液 (7.5 mmol/L)
- 1.0 mL FeSO₄溶液 (7.5 mmol/L) → 立即混匀
- 再加入 1.0 mL H₂O₂溶液 (0.1%) → 立即混匀
- 混匀后，置于37°C恒温水浴中反应60分钟（或根据预实验优化确定的最佳时间）。
- 反应完毕，取出冷却至室温，必要时可离心（如3000 rpm, 10分钟）除去沉淀（若有）。
- 用分光光度计在536 nm波长处测定吸光度，记为A<sub>损伤</sub>。
- 取一支试管，依次加入：
- 样品组：
- 取一支试管，依次加入：
- 1.0 mL PBS (0.2 mol/L, pH 7.4)
- 1.0 mL 邻二氮菲溶液 (7.5 mmol/L)
- 1.0 mL 待测样品溶液（特定浓度）→ 混匀
- 再加入 1.0 mL FeSO₄溶液 (7.5 mmol/L) → 立即混匀
- 最后加入 1.0 mL H₂O₂溶液 (0.1%) → 立即混匀
- 混匀后，置于37°C恒温水浴中反应60分钟（时间同损伤对照组）。
- 反应完毕，取出冷却至室温，必要时离心。
- 用分光光度计在536 nm波长处测定吸光度，记为A<sub>样品</sub>。
- 取一支试管，依次加入：
- 平行实验： 每个对照组和样品组的每个浓度均应设置至少3个平行管以确保结果可靠性。
五、结果计算
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羟自由基清除率（Scavenging Activity, %）：
清除率 = [ (A<sub>样品</sub> - A<sub>损伤</sub>) / (A<sub>空白</sub> - A<sub>损伤</sub>) ] × 100%- A<sub>样品</sub>：加入待测样品反应后的吸光度。
- A<sub>损伤</sub>：损伤对照组的吸光度（只有Fenton反应损伤，无保护）。
- A<sub>空白</sub>：空白对照组的吸光度（无Fenton反应损伤，络合物完整）。
(A<sub>空白</sub> - A<sub>损伤</sub>)代表体系潜在的最大损伤程度（吸光度下降最大值）。(A<sub>样品</sub> - A<sub>损伤</sub>)代表待测样品对损伤的保护程度（减少的吸光度下降值）。- 清除率越高，表示样品清除羟自由基的能力越强。
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IC<sub>50</sub>值：
- 对待测样品进行不同浓度梯度的实验。
- 计算每个浓度对应的清除率。
- 以样品浓度为横坐标（X轴），清除率为纵坐标（Y轴），绘制剂量-效应曲线。
- IC<sub>50</sub>值是指样品清除率达到50%时对应的样品浓度（单位通常为μg/mL或μmol/L）。IC<sub>50</sub>值越小，表明该样品清除羟自由基所需的浓度越低，即其清除能力越强。这是比较不同样品羟自由基清除活性最常用的指标。
六、影响实验结果的关键因素
- pH值： 反应体系的pH对Fenton反应速率、络合物稳定性及抗氧化剂活性均有显著影响。通常采用接近生理条件的pH 7.4。
- 反应温度： 温度影响反应速率。标准方法通常在37°C（模拟体温）进行。
- 反应时间： 需要足够时间让Fenton反应发生和自由基被清除。60分钟是常用时间，可根据体系优化。
- 试剂浓度与比例： Fe²⁺、H₂O₂、邻二氮菲的浓度及其比例直接影响自由基产率和检测灵敏度，需严格按方法设定。
- 溶剂效应： 溶解样品的溶剂可能干扰Fenton反应或显色体系（如高浓度乙醇可能本身是自由基清除剂），需设置溶剂对照组评估影响。
- 样品浓度范围： 应涵盖低清除率到高清除率（接近100%）的范围，以便准确绘制曲线计算IC<sub>50</sub>。
七、注意事项
- 新鲜配制： Fe²⁺溶液极易被氧化，必须临用前新鲜配制。H₂O₂溶液也应避免长期储存。
- 避光操作： 邻二氮菲溶液对光敏感，应避光保存和操作。
- 加样顺序： 加样顺序对反应启动很重要。通常先加缓冲液和显色剂，再加入Fe²⁺和H₂O₂（或其混合液），且加入后需立即混匀以确保各组反应起始条件一致。
- 精确计时与控温： 反应时间和温度必须严格控制，以确保结果的可比性。
- 排除干扰： 样品溶液本身可能有颜色或浊度，需设置样品空白管（只含样品和缓冲液，不含Fenton试剂和显色剂）进行背景扣除。
- 溶剂选择： 若样品需用乙醇等有机溶剂溶解，需评估该溶剂浓度对体系的干扰程度（如乙醇浓度不宜过高）。需设置溶剂对照组（用等体积溶剂替代步骤中的样品溶液）。
- 反应终止： 反应达到预定时间后应及时终止（如冷却），防止反应过度进行。
- 沉淀处理： 反应后若出现沉淀，需离心后取上清液测定吸光度。
八、方法评价
- 优点： 原理清晰，操作相对简便，成本较低，灵敏度较高（能检测中等强度的羟自由基清除剂），无需特殊大型仪器（只需分光光度计），是目前应用最广泛的体外羟自由基清除能力评价方法之一。
- 局限性：
- 邻二氮菲-Fe²⁺络合物并非·OH的特异性探针，其他强氧化剂也可能破坏它。
- 反应在非生理浓度的H₂O₂和金属离子存在下进行（通常高于生理水平）。
- 是体外化学模拟体系，不能完全等同于复杂的生物体内环境（如酶系统的存在、扩散限制等）。
- 结果可能受特定反应条件（如pH、离子强度）影响较大。
- 对于本身具有强还原性或络合金属离子能力的样品（如某些多酚、螯合剂），其作用机制除了直接清除自由基外，还可能包括抑制Fenton反应（减少·OH生成），这在该方法中难以区分。
结论
邻二氮菲-Fe²⁺氧化法是一种基于Fenton反应生成羟自由基并通过显色反应定量检测物质清除能力的常规体外方法。严格遵守操作规程并注意关键影响因素，可以获得可靠的结果，用于比较不同物质或不同条件下物质的羟自由基清除活性。该方法广泛服务于食品科学、营养学、天然产物化学、药理学及抗氧化剂开发等领域的研究。但需牢记其体外模型的局限性，阐释结果时应结合体内模型或更接近生理条件的模型进行综合判断。