二氢黄酮醇还原酶(DFR)活性检测方法
一、 引言
二氢黄酮醇还原酶是植物类黄酮/花青素生物合成途径中的关键酶，催化二氢黄酮醇（如二氢槲皮素、二氢山柰酚）还原生成相应的无色花色素。其活性直接影响花青素等有色物质的积累，对植物花色、果实色泽形成及抗逆性具有重要作用。本方法描述了基于分光光度法测定DFR酶活性的标准化流程。
二、 实验原理
在还原型辅酶II (NADPH) 存在下，DFR催化底物二氢黄酮醇发生还原反应，生成相应的无色花色素，同时伴随NADPH在340 nm波长处吸光值的下降。通过测定单位时间内反应体系中NADPH吸光值（OD₃₄₀）的减少量，即可计算DFR的酶活性。反应方程式如下：
二氢黄酮醇 + NADPH + H⁺ → 无色花色素 + NADP⁺
三、 实验材料与试剂
- 样品： 新鲜植物组织（花瓣、果皮、叶片等）或经处理的酶粗提液。
- 主要试剂：
- 磷酸钾缓冲液 (KPi)：100 mM, pH 7.0 (含1 mM EDTA，1 mM DTT，10% (v/v) 甘油)。注：使用前新鲜配制，DTT临用前加入。
- 底物储存液：二氢槲皮素或特异性底物（如二氢山柰酚、二氢杨梅素），溶于少量DMSO中，配制成适宜浓度储存液（如10 mM）。注：分装避光-20℃保存。
- 辅酶溶液：NADPH钠盐，用超纯水配制，临用前新鲜配制（如2 mM）。
- 蛋白浓度测定试剂盒（如Bradford法试剂盒）。
- 超纯水。
- DMSO（分析纯）。
- EDTA (乙二胺四乙酸二钠盐，分析纯)。
- DTT (二硫苏糖醇，分析纯)。
- 甘油（分析纯）。
- 主要仪器与耗材：
- 紫外-可见分光光度计（配恒温比色皿架）
- 低温高速离心机
- 恒温水浴锅或金属浴
- 研钵/研杵或组织研磨仪（预冷）
- 移液器及配套无菌吸头
- 1.5 mL 离心管（预冷）
- 石英比色皿（光程1 cm）
- pH计
- 冰盒
四、 实验步骤
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酶粗提液制备 (所有操作在冰上或4℃进行)：
- 准确称取适量（如0.5-1.0 g）新鲜植物组织，迅速置于预冷的研钵中，根据需要可加入少量液氮快速研磨成细粉。
- 加入预冷的提取缓冲液 (100 mM KPi, pH 7.0, 含1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10% 甘油)，提取液体积(mL)约为组织鲜重(g)的2-4倍。冰浴下充分研磨匀浆。
- 将匀浆液转移至预冷的离心管中，4℃下以12,000 - 15,000 ×g 离心20分钟。
- 小心吸取上清液（即为酶粗提液），立即置于冰上备用或分装后暂时存于冰上（建议尽快测定，通常在4小时内完成）。
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蛋白浓度测定 (Bradford法示例)：
- 按蛋白浓度测定试剂盒说明书操作，使用牛血清白蛋白(BSA)制作标准曲线。
- 将酶粗提液适当稀释后参与测定。
- 计算酶粗提液的蛋白浓度(mg/mL)。
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DFR活性测定 (分光光度法)：
- 预热： 启动分光光度计，设定温度为30℃（或其他适宜温度，常用25-30℃），波长340 nm。预热至少15分钟使温度稳定。
- 反应体系配制 (终体积1 mL)： 在预冷的石英比色皿中加入以下组分：
- 磷酸钾缓冲液 (100 mM, pH 7.0)：870 µL
- NADPH溶液 (2 mM)：50 µL (终浓度0.1 mM)
- 酶粗提液：50 µL (根据预估活性调整用量，使ΔOD₃₄₀/min在0.01 - 0.05之间较理想)
- 启动试剂： 底物溶液 (如10 mM 二氢槲皮素)：30 µL (终浓度0.3 mM)
- 注：可设置不含底物的对照反应（以等体积缓冲液代替底物溶液）以扣除内源性NADPH消耗。
- 混匀与平衡： 轻轻颠倒混匀比色皿内容物数次。立即放入预热的比色皿架中，盖上盖子防止挥发。
- 测定： 在340 nm波长下，启动计时器，连续记录吸光度值变化至少3-5分钟（或直至线性下降趋势明显）。通常读取初始30-60秒后的稳定线性下降区间数据。
- 计算斜率： 以时间（分钟）为横坐标，OD₃₄₀值为纵坐标作图，计算线性下降阶段的斜率（ΔOD₃₄₀ / min）。
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空白对照：
- 酶空白： 用等体积的提取缓冲液代替酶粗提液加入反应体系（含底物和NADPH），测定其OD₃₄₀随时间变化。此空白用于评估非酶促反应或底物/NADPH不稳定造成的背景变化。
- 底物空白： 用等体积缓冲液代替底物溶液（含酶粗提液和NADPH）。此空白用于评估酶液中可能存在的不依赖底物的NADPH氧化活性。
五、 结果计算
- 计算净反应速率：
样品反应速率 (ΔOD₃₄₀/min) - [酶空白速率 (ΔOD₃₄₀/min) 或 底物空白速率 (ΔOD₃₄₀/min)]
注：选择背景更高或更相关的空白进行扣除。通常酶空白更常用。 - 计算酶活性：
酶活性 (nkat/mL 或 nkat/mg prot) = (ΔOD₃₄₀/min * Vt * 1000) / (ε * d * Vs * P)
- ΔOD₃₄₀/min： 扣除空白后的净吸光度下降速率（每分钟变化值）。
- Vt： 反应体系总体积 (mL)，此处为1.0 mL。
- 1000： 将摩尔(mol)转换为毫摩尔(mmol)的转换因子 (1 mol = 1000 mmol)。
- ε： NADPH在340 nm处的摩尔消光系数 (6.22 × 10³ L mol⁻¹ cm⁻¹)。
- d： 比色皿光程 (cm)，标准为1 cm。
- Vs： 反应体系中加入的酶液体积 (mL)，此处为0.05 mL。
- P： 酶粗提液的蛋白浓度 (mg/mL)。若计算比活力则为mg prot，若计算总体活力则为mL（即Vs * P = mg prot）。
简化公式 (当 Vt=1.0 mL, d=1 cm)：
酶活性 (nkat/mL) = (ΔOD₃₄₀/min * 1000) / (6.22 * Vs * P) * P * 1000
(注意单位：nkat = nmol/s)
比活力 [nkat/mg prot] = (ΔOD₃₄₀/min * 1000) / (6.22 * Vs * P)
(Vs单位为mL，P单位为mg/mL)
单位解释：nkat（纳卡特）表示每秒钟催化转化1纳摩尔（nmol）底物所需的酶量。
六、 质量控制与注意事项
- 新鲜度： 植物材料应新鲜采集，尽快处理。酶粗提液制备后宜尽快测定活性，低温操作延缓失活。
- 温度控制： 反应温度需严格恒定，比色皿预热充分。
- 底物特异性： DFR底物偏好性因植物物种而异（槲皮素、山柰酚、杨梅素衍生物）。需根据研究对象选择合适的底物（常用二氢槲皮素）。底物溶解性差时，DMSO浓度需控制（终浓度通常<3%）。
- 线性范围： 确保反应初速度在线性范围内（ΔOD₃₄₀/min随时间恒定）。若酶量过高导致下降过快（ΔOD₃₄₀/min > 0.1），需稀释酶液；若过低则增加酶量或延长测定时间。
- 背景扣除： 务必设置并扣除合适的空白对照，特别是内源性色素或杂质可能干扰吸光度测定时。
- 酶稳定性： 提取缓冲液中需添加EDTA（螯合金属离子）、DTT（提供还原环境）、甘油（稳定酶蛋白），以最大程度保护酶活性。
- 试剂纯度： NADPH极易氧化，需新鲜配制并使用高纯度试剂。底物避光保存。
- 重复性： 每个样品应设置至少2-3个生物学重复和技术重复。结果表示为平均值±标准差(SD)。
七、 应用意义
- 植物生理研究： 解析植物花色、果色发育的分子机制及调控网络。
- 遗传育种： 筛选花、果颜色变异材料，评估基因工程改良效果的生化指标。
- 环境响应： 研究非生物胁迫（光、温、干旱）及生物胁迫下类黄酮代谢通路的适应性变化。
- 次生代谢调控： 探索代谢工程提高目标类黄酮物质产量的关键节点。
八、 注释
- 缓冲液配方 (100 mM KPi, pH 7.0)：
- 溶液A：100 mM K₂HPO₄ (17.42 g/L)
- 溶液B：100 mM KH₂PO₄ (13.61 g/L)
- 使用pH计，将溶液A加入溶液B中，调节至pH 7.0。
- 加入EDTA至1 mM (0.372 g/L)，甘油至10% (v/v) (100 mL/L)。
- 使用前加入DTT至1 mM (0.154 g/L)。
- 底物选择： 二氢槲皮素是许多物种DFR的良好底物，但特定物种可能偏好二氢山柰酚或二氢杨梅素。需查阅文献或预实验确定最佳底物。
- 替代方法： 对于色素含量极高的样品或需要产物定量的研究，可考虑使用高效液相色谱法(HPLC)检测无色花色素或其氧化产物花青素的生成量。
本方法提供了DFR活性检测的标准操作程序，研究者可根据具体实验条件和研究对象进行适当优化（如温度、pH、底物浓度）。严格遵守操作规范是获得可靠、可重复数据的关键。