二氢黄酮醇还原酶(DFR)活性检测

发布时间:2025-06-27 17:25:11 阅读量:1 作者:生物检测中心

二氢黄酮醇还原酶(DFR)活性检测方法

一、 引言
二氢黄酮醇还原酶是植物类黄酮/花青素生物合成途径中的关键酶,催化二氢黄酮醇(如二氢槲皮素、二氢山柰酚)还原生成相应的无色花色素。其活性直接影响花青素等有色物质的积累,对植物花色、果实色泽形成及抗逆性具有重要作用。本方法描述了基于分光光度法测定DFR酶活性的标准化流程。

二、 实验原理
在还原型辅酶II (NADPH) 存在下,DFR催化底物二氢黄酮醇发生还原反应,生成相应的无色花色素,同时伴随NADPH在340 nm波长处吸光值的下降。通过测定单位时间内反应体系中NADPH吸光值(OD₃₄₀)的减少量,即可计算DFR的酶活性。反应方程式如下:

二氢黄酮醇 + NADPH + H⁺ → 无色花色素 + NADP⁺

三、 实验材料与试剂

  1. 样品: 新鲜植物组织(花瓣、果皮、叶片等)或经处理的酶粗提液。
  2. 主要试剂:
    • 磷酸钾缓冲液 (KPi):100 mM, pH 7.0 (含1 mM EDTA,1 mM DTT,10% (v/v) 甘油)。注:使用前新鲜配制,DTT临用前加入。
    • 底物储存液:二氢槲皮素或特异性底物(如二氢山柰酚、二氢杨梅素),溶于少量DMSO中,配制成适宜浓度储存液(如10 mM)。注:分装避光-20℃保存。
    • 辅酶溶液:NADPH钠盐,用超纯水配制,临用前新鲜配制(如2 mM)。
    • 蛋白浓度测定试剂盒(如Bradford法试剂盒)。
    • 超纯水。
    • DMSO(分析纯)。
    • EDTA (乙二胺四乙酸二钠盐,分析纯)。
    • DTT (二硫苏糖醇,分析纯)。
    • 甘油(分析纯)。
  3. 主要仪器与耗材:
    • 紫外-可见分光光度计(配恒温比色皿架)
    • 低温高速离心机
    • 恒温水浴锅或金属浴
    • 研钵/研杵或组织研磨仪(预冷)
    • 移液器及配套无菌吸头
    • 1.5 mL 离心管(预冷)
    • 石英比色皿(光程1 cm)
    • pH计
    • 冰盒
 

四、 实验步骤

  1. 酶粗提液制备 (所有操作在冰上或4℃进行):

    • 准确称取适量(如0.5-1.0 g)新鲜植物组织,迅速置于预冷的研钵中,根据需要可加入少量液氮快速研磨成细粉。
    • 加入预冷的提取缓冲液 (100 mM KPi, pH 7.0, 含1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10% 甘油),提取液体积(mL)约为组织鲜重(g)的2-4倍。冰浴下充分研磨匀浆。
    • 将匀浆液转移至预冷的离心管中,4℃下以12,000 - 15,000 ×g 离心20分钟。
    • 小心吸取上清液(即为酶粗提液),立即置于冰上备用或分装后暂时存于冰上(建议尽快测定,通常在4小时内完成)。
  2. 蛋白浓度测定 (Bradford法示例):

    • 按蛋白浓度测定试剂盒说明书操作,使用牛血清白蛋白(BSA)制作标准曲线。
    • 将酶粗提液适当稀释后参与测定。
    • 计算酶粗提液的蛋白浓度(mg/mL)。
  3. DFR活性测定 (分光光度法):

    • 预热: 启动分光光度计,设定温度为30℃(或其他适宜温度,常用25-30℃),波长340 nm。预热至少15分钟使温度稳定。
    • 反应体系配制 (终体积1 mL): 在预冷的石英比色皿中加入以下组分:
      • 磷酸钾缓冲液 (100 mM, pH 7.0):870 µL
      • NADPH溶液 (2 mM):50 µL (终浓度0.1 mM)
      • 酶粗提液:50 µL (根据预估活性调整用量,使ΔOD₃₄₀/min在0.01 - 0.05之间较理想)
      • 启动试剂: 底物溶液 (如10 mM 二氢槲皮素):30 µL (终浓度0.3 mM)
      • 注:可设置不含底物的对照反应(以等体积缓冲液代替底物溶液)以扣除内源性NADPH消耗。
    • 混匀与平衡: 轻轻颠倒混匀比色皿内容物数次。立即放入预热的比色皿架中,盖上盖子防止挥发。
    • 测定: 在340 nm波长下,启动计时器,连续记录吸光度值变化至少3-5分钟(或直至线性下降趋势明显)。通常读取初始30-60秒后的稳定线性下降区间数据。
    • 计算斜率: 以时间(分钟)为横坐标,OD₃₄₀值为纵坐标作图,计算线性下降阶段的斜率(ΔOD₃₄₀ / min)。
  4. 空白对照:

    • 酶空白: 用等体积的提取缓冲液代替酶粗提液加入反应体系(含底物和NADPH),测定其OD₃₄₀随时间变化。此空白用于评估非酶促反应或底物/NADPH不稳定造成的背景变化。
    • 底物空白: 用等体积缓冲液代替底物溶液(含酶粗提液和NADPH)。此空白用于评估酶液中可能存在的不依赖底物的NADPH氧化活性。
 

五、 结果计算

  1. 计算净反应速率:

    样品反应速率 (ΔOD₃₄₀/min) - [酶空白速率 (ΔOD₃₄₀/min) 或 底物空白速率 (ΔOD₃₄₀/min)]
    注:选择背景更高或更相关的空白进行扣除。通常酶空白更常用。

  2. 计算酶活性:

    酶活性 (nkat/mL 或 nkat/mg prot) = (ΔOD₃₄₀/min * Vt * 1000) / (ε * d * Vs * P)

    • ΔOD₃₄₀/min: 扣除空白后的净吸光度下降速率(每分钟变化值)。
    • Vt: 反应体系总体积 (mL),此处为1.0 mL。
    • 1000: 将摩尔(mol)转换为毫摩尔(mmol)的转换因子 (1 mol = 1000 mmol)。
    • ε: NADPH在340 nm处的摩尔消光系数 (6.22 × 10³ L mol⁻¹ cm⁻¹)。
    • d: 比色皿光程 (cm),标准为1 cm。
    • Vs: 反应体系中加入的酶液体积 (mL),此处为0.05 mL。
    • P: 酶粗提液的蛋白浓度 (mg/mL)。若计算比活力则为mg prot,若计算总体活力则为mL(即Vs * P = mg prot)。
     

    简化公式 (当 Vt=1.0 mL, d=1 cm):
    酶活性 (nkat/mL) = (ΔOD₃₄₀/min * 1000) / (6.22 * Vs * P) * P * 1000
    (注意单位:nkat = nmol/s)
    比活力 [nkat/mg prot] = (ΔOD₃₄₀/min * 1000) / (6.22 * Vs * P)
    (Vs单位为mL,P单位为mg/mL)
    单位解释: nkat(纳卡特)表示每秒钟催化转化1纳摩尔(nmol)底物所需的酶量。

 

六、 质量控制与注意事项

  1. 新鲜度: 植物材料应新鲜采集,尽快处理。酶粗提液制备后宜尽快测定活性,低温操作延缓失活。
  2. 温度控制: 反应温度需严格恒定,比色皿预热充分。
  3. 底物特异性: DFR底物偏好性因植物物种而异(槲皮素、山柰酚、杨梅素衍生物)。需根据研究对象选择合适的底物(常用二氢槲皮素)。底物溶解性差时,DMSO浓度需控制(终浓度通常<3%)。
  4. 线性范围: 确保反应初速度在线性范围内(ΔOD₃₄₀/min随时间恒定)。若酶量过高导致下降过快(ΔOD₃₄₀/min > 0.1),需稀释酶液;若过低则增加酶量或延长测定时间。
  5. 背景扣除: 务必设置并扣除合适的空白对照,特别是内源性色素或杂质可能干扰吸光度测定时。
  6. 酶稳定性: 提取缓冲液中需添加EDTA(螯合金属离子)、DTT(提供还原环境)、甘油(稳定酶蛋白),以最大程度保护酶活性。
  7. 试剂纯度: NADPH极易氧化,需新鲜配制并使用高纯度试剂。底物避光保存。
  8. 重复性: 每个样品应设置至少2-3个生物学重复和技术重复。结果表示为平均值±标准差(SD)。
 

七、 应用意义

  • 植物生理研究: 解析植物花色、果色发育的分子机制及调控网络。
  • 遗传育种: 筛选花、果颜色变异材料,评估基因工程改良效果的生化指标。
  • 环境响应: 研究非生物胁迫(光、温、干旱)及生物胁迫下类黄酮代谢通路的适应性变化。
  • 次生代谢调控: 探索代谢工程提高目标类黄酮物质产量的关键节点。
 

八、 注释

  • 缓冲液配方 (100 mM KPi, pH 7.0):
    • 溶液A:100 mM K₂HPO₄ (17.42 g/L)
    • 溶液B:100 mM KH₂PO₄ (13.61 g/L)
    • 使用pH计,将溶液A加入溶液B中,调节至pH 7.0。
    • 加入EDTA至1 mM (0.372 g/L),甘油至10% (v/v) (100 mL/L)。
    • 使用前加入DTT至1 mM (0.154 g/L)。
  • 底物选择: 二氢槲皮素是许多物种DFR的良好底物,但特定物种可能偏好二氢山柰酚或二氢杨梅素。需查阅文献或预实验确定最佳底物。
  • 替代方法: 对于色素含量极高的样品或需要产物定量的研究,可考虑使用高效液相色谱法(HPLC)检测无色花色素或其氧化产物花青素的生成量。
 

本方法提供了DFR活性检测的标准操作程序,研究者可根据具体实验条件和研究对象进行适当优化(如温度、pH、底物浓度)。严格遵守操作规范是获得可靠、可重复数据的关键。