二胺氧化酶(DAO)活性检测

发布时间:2025-06-27 17:23:41 阅读量:2 作者:生物检测中心

以下为关于二胺氧化酶(DAO)活性检测的完整技术文章,内容严格避免任何企业或品牌名称,仅聚焦于科学原理与方法:


二胺氧化酶(DAO)活性检测技术指南

一、概述

二胺氧化酶(Diamine Oxidase, DAO)是一种含铜的胺氧化酶,主要分布于哺乳动物肠道黏膜、胎盘、肾脏等组织。其核心功能是催化组胺、腐胺(丁二胺)等生物胺的氧化脱氨反应,生成相应的醛类、氨和过氧化氢。DAO活性检测对评估肠道黏膜屏障功能组胺代谢异常(如组胺不耐受)及妊娠相关疾病具有重要临床意义。


二、检测原理

DAO活性检测基于其催化底物(如腐胺)氧化脱氨的酶促反应:
反应式
腐胺(Putrescine) + H₂O + O₂ → 4-氨基丁醛 + NH₃ + H₂O₂

产物4-氨基丁醛在碱性条件下自发环化为Δ¹-吡咯啉(Δ¹-Pyrroline),后者可与显色剂(如邻氨基苯甲醛)反应生成黄色化合物,或在分光光度法中直接于440 nm波长下检测Δ¹-吡咯啉的吸光度变化(ε≈1860 L·mol⁻¹·cm⁻¹)。
活性单位定义:37℃条件下,每分钟催化生成1 μmol Δ¹-吡咯啉所需的酶量为1单位(U)。


三、实验材料与方法

1. 样本制备
  • 血清/血浆:静脉血采集后,EDTA或肝素抗凝,4℃离心(2000×g, 10 min),分装后-80℃保存(避免反复冻融)。
  • 组织样本:取肠道黏膜等组织,匀浆后离心取上清液,蛋白浓度定量校正。
 
2. 试剂组成
组分 终浓度
Tris-HCl缓冲液 100 mmol/L, pH 7.2
腐胺(底物) 0.2 mmol/L
过氧化物酶(POD) 5 U/mL
4-氨基安替比林 1 mmol/L
酚类显色剂 10 mmol/L

备注:亦可采用Δ¹-吡咯啉直接分光光度法,无需显色系统。

3. 操作流程
  1. 反应体系构建(200 μL体系):
    • 缓冲液 + 底物 + 显色剂 → 37℃预温育5 min
    • 加入样本(血清或组织匀浆上清)→ 启动反应
  2. 动力学监测
    于440 nm波长下,每30秒记录吸光度(A),持续10 min。
  3. 活性计算
    DAO活性 (U/L) = (ΔA/min × V_total × 1000) / (ε × d × V_sample)
    • ΔA/min:每分钟吸光度变化
    • V_total:反应总体积(mL)
    • ε:Δ¹-吡咯啉摩尔消光系数(1860 L·mol⁻¹·cm⁻¹)
    • d:比色皿光径(cm)
    • V_sample:样本体积(mL)
 

四、关键注意事项

  1. 样本稳定性:DAO活性易降解,样本采集后需立即处理,-80℃保存≤3个月。
  2. 干扰物质
    • 避免溶血(红细胞含高活性胺氧化酶)。
    • 螯合剂(如EDTA)可抑制铜依赖性DAO活性,抗凝剂选择需谨慎。
  3. 底物特异性:腐胺为最适底物,组胺亦可作底物但Km值较高。
  4. 质量控制:每批检测需包含正常对照低活性对照(加热灭活样本)。
 

五、临床参考范围

样本类型 参考区间(成人) 备注
血清DAO 3–15 U/mL 空腹检测,个体差异显著
血浆DAO 2–12 U/mL 抗凝剂影响需校正
临床解读    
- 升高:急性肠道黏膜损伤、炎症性肠病活动期    
- 降低:DAO缺乏症、慢性肠黏膜萎缩、部分妊娠并发症    

六、应用场景

  1. 肠道屏障功能评估:血清DAO活性与肠黏膜完整性呈负相关,是肠通透性标志物。
  2. 组胺不耐受诊断:DAO活性低下导致组胺降解障碍,引发过敏样症状。
  3. 产科监测:胎盘DAO活性异常与子痫前期、流产风险相关。
  4. 药物研发:评价保护肠黏膜药物的功效(如化疗后黏膜修复)。
 

七、方法学比较

方法 灵敏度 特异性 适用场景
分光光度法 中等 常规临床检测
荧光法 微量样本研究
ELISA 高通量筛查

分光光度法因操作简便、成本低,仍为实验室首选。


八、参考文献

  1. García-Martín E, et al. Clin Chim Acta. 2015; 444: 134-139.
  2. Maintz L, et al. Am J Clin Nutr. 2007; 85(5): 1185-1196.
  3. Klocker J, et al. Inflamm Bowel Dis. 2013; 19(11): 2364-2372.
 

本指南严格遵循学术中立原则,内容基于公开发表的科学文献整合而成,可供临床实验室及研究人员规范操作流程使用。