葡萄糖氧化酶(GOD)活性检测

发布时间:2025-06-27 17:21:36 阅读量:2 作者:生物检测中心

葡萄糖氧化酶(GOD)活性检测:原理、方法与操作流程

葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase, GOD, EC 1.1.3.4)是一种重要的氧化还原酶,广泛应用于食品工业、生物传感器、临床诊断和生物技术等领域。准确测定其活性是评估酶制剂性能、优化生产工艺和应用效果的关键。以下介绍基于比色法的GOD活性检测标准流程,该方法基于过氧化物酶偶联反应,原理清晰、操作简便、结果可靠。

一、 检测原理

GOD催化β-D-葡萄糖的氧化反应,生成葡萄糖酸和过氧化氢(H₂O₂):

β-D-葡萄糖 + O₂ + H₂O → D-葡萄糖酸-1,5-内酯 + H₂O₂
D-葡萄糖酸-1,5-内酯 + H₂O → D-葡萄糖酸

生成的H₂O₂在过氧化物酶(Peroxidase, POD)存在下,将无色的色原体(如邻联茴香胺)氧化生成有色产物(如邻联茴香胺的二聚体,呈棕红色)。该有色产物的生成量(可通过比色法测定其在特定波长下的吸光度)与H₂O₂的量成正比,从而间接反映GOD的催化活性。

二、 主要试剂与溶液配制

  1. 磷酸盐缓冲液(0.1 M, pH 7.0): 准确称取磷酸二氢钠(NaH₂PO₄·2H₂O)和磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)或磷酸二氢钾(KH₂PO₄)和磷酸氢二钾(K₂HPO₄),溶解于适量蒸馏水,调pH至7.0,定容至所需体积。4℃保存。
  2. 葡萄糖底物溶液(1.0 M): 准确称取无水葡萄糖,溶解于上述磷酸盐缓冲液(0.1 M, pH 7.0)中。此溶液需当日配制或使用前新鲜配制(葡萄糖溶液久置易发生异构化)。
  3. 显色试剂(邻联茴香胺/OAB溶液):
    • 称取适量过氧化物酶(POD)。
    • 称取适量邻联茴香胺盐酸盐(OAB)。
    • 将POD和OAB共同溶解于预先配制的水中(或磷酸盐缓冲液中),混合均匀。此溶液不稳定,需避光低温保存(如4℃),建议临用前配制或在检测当天配制。
    • 注意:也可选用其他显色底物(如ABTS、TMB),需相应调整测定波长。
  4. 待测GOD酶液: 根据预估活性,用冷的磷酸盐缓冲液(0.1 M, pH 7.0)将酶样品稀释至适当浓度(通常使反应速率在吸光度变化线性范围内)。稀释后的酶液需置于冰浴中备用。
  5. 反应终止液(可选): 根据所选显色底物而定。如使用OAB,常用浓硫酸(如2 M或4 M)终止反应并稳定颜色。
 

三、 仪器设备

  1. 紫外-可见分光光度计
  2. 恒温水浴锅(控温精度±0.2℃)
  3. 计时器(秒表)
  4. 移液器(精确移取微量液体)
  5. 试管或比色皿(光程通常为1 cm)
  6. 冰浴装置
 

四、 标准操作步骤(比色法 - 以OAB/POD体系为例)

  1. 预热与准备: 将恒温水浴锅温度设定为检测所需温度(通常为30℃或37℃)。将磷酸盐缓冲液、葡萄糖底物溶液、显色试剂(OAB/POD)在检测温度下预平衡至少10分钟。将待测(稀释)酶液置于冰浴中。
  2. 反应体系: 取一支洁净干燥的试管(或比色皿),依次加入:
    • 磷酸盐缓冲液(0.1 M, pH 7.0): 适量(保证最终反应体积)
    • 葡萄糖底物溶液(1.0 M): 一定体积(确保反应液中葡萄糖终浓度在饱和范围内,通常为100 mM左右)
    • 显色试剂(OAB/POD): 一定体积(确保体系中POD和OAB浓度足够)
    • 用移液器混匀。
  3. 启动反应: 将混合好的反应体系置于恒温水浴锅中保温2-3分钟,使其温度平衡。迅速加入准确计量的稀释酶液(如50 μL),立即混匀并启动计时器(时刻T0)。
  4. 反应与测定: 在恒温水浴锅中进行反应。在反应进行到预设时间点(如T1=1分钟)时,迅速从反应体系中取出一定体积(如1 mL或2 mL)的混合液,转移至一支预先加入适量反应终止液(如1 mL 4M H₂SO₄)的试管中(或直接测量有色产物在特定波长下的吸光度,如果颜色稳定时间较长且无需立即终止)。剧烈振荡混匀以终止反应(若使用终止液)。
  5. 吸光度测定: 将终止后的反应液(或未终止的反应液)转移入比色皿中。以未加酶液(用等量缓冲液替代)但包含所有其他成分的反应终止液(或反应液)作为空白对照。在分光光度计上,于有色产物的最大吸收波长(如使用OAB约为440 nm或540 nm,具体波长需根据实际显色情况和仪器校准确定)处测定吸光度(A)。
  6. 计算吸光度变化: 记录样品吸光度(A_sample)和空白吸光度(A_blank)。计算反应时间内的吸光度变化值(ΔA): ΔA = A_sample - A_blank。
  7. 活性计算:
    • 酶活力定义: 在特定反应条件下(温度、pH、底物浓度),每分钟催化生成1 μmol H₂O₂所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)。
    • 计算原理: 根据朗伯-比尔定律,ΔA正比于有色产物的浓度,有色产物的浓度等同于反应消耗的H₂O₂浓度(C_H2O2)。摩尔吸光系数(ε)是特定波长下单位浓度有色产物的吸光度(L mol⁻¹ cm⁻¹)。通常通过标准曲线或文献值获得ε(如OAB在440nm处ε约为6.58×10³ L mol⁻¹ cm⁻¹)。
    • 酶活力计算:
      1. 计算H₂O₂生成量(μmol): H₂O₂生成量 (μmol) = (ΔA * Vt) / (ε * d)
        • ΔA: 吸光度变化值(A_sample - A_blank)
        • Vt: 待测样品体积(L),通常是终止反应后用于测定的总体积(若终止反应)或取出的反应液体积(若直接测定)。需注意单位转换(L)。
        • ε: 有色产物在测定波长下的摩尔吸光系数(L mol⁻¹ cm⁻¹)
        • d: 比色皿光程(cm)
      2. 计算酶活力(U/mL):
        • 若待测酶液为粗酶液或酶制剂溶液:
          酶活力 (U/mL) = (H₂O₂生成量 (μmol) * Df) / (t * V_e)
        • 若需计算比活力(U/mg protein):
          比活力 (U/mg) = (H₂O₂生成量 (μmol) * Df) / (t * V_e * C_pro)
        • Df: 待测酶液在反应体系中的总体稀释倍数(相对于原始酶液)
        • t: 反应时间(min)
        • V_e: 加入到反应体系中的待测酶液体积(mL)
        • C_pro: 原始酶液或待测酶液中蛋白质浓度(mg/mL,需通过其他方法如BCA、Bradford法测定)
 

五、 注意事项

  1. 严格控制温度: 酶反应速率对温度敏感,务必保证反应在水浴中恒温进行,温度波动需≤±0.2℃。
  2. 准确计时: 从加入酶液开始到终止反应(或测定吸光度)的时间间隔需严格控制且精确记录。反应初期(1-3分钟)通常在线性范围内。
  3. 底物浓度: 葡萄糖浓度应远高于Km值(通常在饱和浓度下进行,如100 mM),以保证反应为零级反应(速率仅与酶浓度有关)。
  4. 酶液稀释: 酶液浓度应调整至使ΔA/min在0.05~0.3范围内(线性范围),避免过高浓度导致底物过早耗尽或反应非线性。
  5. 试剂稳定性: 葡萄糖溶液、显色试剂(尤其是OAB)需新鲜配制或妥善冷藏保存,避免失效。OAB见光易分解,需避光操作。
  6. 空白对照: 设置严格空白对照至关重要,应包含除酶以外所有反应组分(加等体积缓冲液替代酶液),以扣除试剂本底吸光度。
  7. 摩尔吸光系数: ε值需准确可靠。建议使用文献中经过验证的值,或自行使用已知浓度的H₂O₂标准品绘制标准曲线进行测定。
  8. 酶活性单位: 明确标示定义酶活力单位的具体条件(温度、pH、底物浓度)。
  9. 终止反应(若适用): 终止液需能有效抑制酶活并使显色稳定。加入终止液后需充分混匀。
  10. 干扰物质: 样品中若存在高浓度的还原性物质(如抗坏血酸)、金属离子或其他可能影响GOD或POD活性的物质,可能会干扰结果,需考虑进行样品预处理或选用抗干扰方法。
 

六、 其他检测方法

除了上述经典的比色法(终点法)外,GOD活性检测还可采用:

  1. 荧光法: 利用H₂O₂与荧光探针(如Amplex Red)在POD催化下生成强荧光产物进行检测,灵敏度更高。
  2. 氧气消耗法: 直接利用氧电极在线监测反应体系中溶解氧浓度的下降速率(Δ[O₂]/Δt),直接对应于GOD催化速率。此法无需偶联POD和显色剂。
  3. 电化学法: 基于酶电极或传感器,检测GOD催化反应产生的电流信号变化(通常与H₂O₂浓度相关)。常用于便携式或在线检测设备。
 

结论:

比色法(基于OAB/POD-H₂O₂显色体系)是测定葡萄糖氧化酶(GOD)活性的经典、可靠且广泛应用的方法。通过严格控制反应条件(温度、时间、底物浓度)、精确操作和合理计算,可以获得准确的酶活数据。理解检测原理和操作细节,并注意关键影响因素,是确保结果重现性和可靠性的关键。根据具体应用场景和精度要求,也可选用荧光法、氧电极法或电化学法等替代方案。