葡萄糖氧化酶(GOD)活性检测 - 中析研究所生物检测中心

葡萄糖氧化酶（GOD）活性检测：原理、方法与操作流程

葡萄糖氧化酶（Glucose Oxidase, GOD, EC 1.1.3.4）是一种重要的氧化还原酶，广泛应用于食品工业、生物传感器、临床诊断和生物技术等领域。准确测定其活性是评估酶制剂性能、优化生产工艺和应用效果的关键。以下介绍基于比色法的GOD活性检测标准流程，该方法基于过氧化物酶偶联反应，原理清晰、操作简便、结果可靠。

一、检测原理

GOD催化β-D-葡萄糖的氧化反应，生成葡萄糖酸和过氧化氢（H₂O₂）：

β-D-葡萄糖 + O₂ + H₂O → D-葡萄糖酸-1,5-内酯 + H₂O₂
D-葡萄糖酸-1,5-内酯 + H₂O → D-葡萄糖酸

生成的H₂O₂在过氧化物酶（Peroxidase, POD）存在下，将无色的色原体（如邻联茴香胺）氧化生成有色产物（如邻联茴香胺的二聚体，呈棕红色）。该有色产物的生成量（可通过比色法测定其在特定波长下的吸光度）与H₂O₂的量成正比，从而间接反映GOD的催化活性。

二、主要试剂与溶液配制

磷酸盐缓冲液（0.1 M, pH 7.0）： 准确称取磷酸二氢钠（NaH₂PO₄·2H₂O）和磷酸氢二钠（Na₂HPO₄·12H₂O）或磷酸二氢钾（KH₂PO₄）和磷酸氢二钾（K₂HPO₄），溶解于适量蒸馏水，调pH至7.0，定容至所需体积。4℃保存。
葡萄糖底物溶液（1.0 M）： 准确称取无水葡萄糖，溶解于上述磷酸盐缓冲液（0.1 M, pH 7.0）中。此溶液需当日配制或使用前新鲜配制（葡萄糖溶液久置易发生异构化）。
显色试剂（邻联茴香胺/OAB溶液）：
- 称取适量过氧化物酶（POD）。
- 称取适量邻联茴香胺盐酸盐（OAB）。
- 将POD和OAB共同溶解于预先配制的水中（或磷酸盐缓冲液中），混合均匀。此溶液不稳定，需避光低温保存（如4℃），建议临用前配制或在检测当天配制。
- 注意：也可选用其他显色底物（如ABTS、TMB），需相应调整测定波长。
待测GOD酶液： 根据预估活性，用冷的磷酸盐缓冲液（0.1 M, pH 7.0）将酶样品稀释至适当浓度（通常使反应速率在吸光度变化线性范围内）。稀释后的酶液需置于冰浴中备用。
反应终止液（可选）： 根据所选显色底物而定。如使用OAB，常用浓硫酸（如2 M或4 M）终止反应并稳定颜色。

三、仪器设备

紫外-可见分光光度计
恒温水浴锅（控温精度±0.2℃）
计时器（秒表）
移液器（精确移取微量液体）
试管或比色皿（光程通常为1 cm）
冰浴装置

四、标准操作步骤（比色法 - 以OAB/POD体系为例）

预热与准备： 将恒温水浴锅温度设定为检测所需温度（通常为30℃或37℃）。将磷酸盐缓冲液、葡萄糖底物溶液、显色试剂（OAB/POD）在检测温度下预平衡至少10分钟。将待测（稀释）酶液置于冰浴中。
反应体系： 取一支洁净干燥的试管（或比色皿），依次加入：
- 磷酸盐缓冲液（0.1 M, pH 7.0）：适量（保证最终反应体积）
- 葡萄糖底物溶液（1.0 M）：一定体积（确保反应液中葡萄糖终浓度在饱和范围内，通常为100 mM左右）
- 显色试剂（OAB/POD）：一定体积（确保体系中POD和OAB浓度足够）
- 用移液器混匀。
启动反应： 将混合好的反应体系置于恒温水浴锅中保温2-3分钟，使其温度平衡。迅速加入准确计量的稀释酶液（如50 μL），立即混匀并启动计时器（时刻T0）。
反应与测定： 在恒温水浴锅中进行反应。在反应进行到预设时间点（如T1=1分钟）时，迅速从反应体系中取出一定体积（如1 mL或2 mL）的混合液，转移至一支预先加入适量反应终止液（如1 mL 4M H₂SO₄）的试管中（或直接测量有色产物在特定波长下的吸光度，如果颜色稳定时间较长且无需立即终止）。剧烈振荡混匀以终止反应（若使用终止液）。
吸光度测定： 将终止后的反应液（或未终止的反应液）转移入比色皿中。以未加酶液（用等量缓冲液替代）但包含所有其他成分的反应终止液（或反应液）作为空白对照。在分光光度计上，于有色产物的最大吸收波长（如使用OAB约为440 nm或540 nm，具体波长需根据实际显色情况和仪器校准确定）处测定吸光度（A）。
计算吸光度变化： 记录样品吸光度（A_sample）和空白吸光度（A_blank）。计算反应时间内的吸光度变化值（ΔA）： ΔA = A_sample - A_blank。
活性计算：
- 酶活力定义： 在特定反应条件下（温度、pH、底物浓度），每分钟催化生成1 μmol H₂O₂所需的酶量定义为一个酶活力单位（U）。
- 计算原理： 根据朗伯-比尔定律，ΔA正比于有色产物的浓度，有色产物的浓度等同于反应消耗的H₂O₂浓度（C_H2O2）。摩尔吸光系数（ε）是特定波长下单位浓度有色产物的吸光度（L mol⁻¹ cm⁻¹）。通常通过标准曲线或文献值获得ε（如OAB在440nm处ε约为6.58×10³ L mol⁻¹ cm⁻¹）。
- 酶活力计算：
  1. 计算H₂O₂生成量（μmol）： H₂O₂生成量 (μmol) = (ΔA * Vt) / (ε * d)
    - ΔA：吸光度变化值（A_sample - A_blank）
    - Vt：待测样品体积（L），通常是终止反应后用于测定的总体积（若终止反应）或取出的反应液体积（若直接测定）。需注意单位转换（L）。
    - ε：有色产物在测定波长下的摩尔吸光系数（L mol⁻¹ cm⁻¹）
    - d：比色皿光程（cm）
  2. 计算酶活力（U/mL）：
    - 若待测酶液为粗酶液或酶制剂溶液：
      酶活力 (U/mL) = (H₂O₂生成量 (μmol) * Df) / (t * V_e)
    - 若需计算比活力（U/mg protein）：
      比活力 (U/mg) = (H₂O₂生成量 (μmol) * Df) / (t * V_e * C_pro)
    - Df：待测酶液在反应体系中的总体稀释倍数（相对于原始酶液）
    - t：反应时间（min）
    - V_e：加入到反应体系中的待测酶液体积（mL）
    - C_pro：原始酶液或待测酶液中蛋白质浓度（mg/mL，需通过其他方法如BCA、Bradford法测定）

五、注意事项

严格控制温度： 酶反应速率对温度敏感，务必保证反应在水浴中恒温进行，温度波动需≤±0.2℃。
准确计时： 从加入酶液开始到终止反应（或测定吸光度）的时间间隔需严格控制且精确记录。反应初期（1-3分钟）通常在线性范围内。
底物浓度： 葡萄糖浓度应远高于Km值（通常在饱和浓度下进行，如100 mM），以保证反应为零级反应（速率仅与酶浓度有关）。
酶液稀释： 酶液浓度应调整至使ΔA/min在0.05～0.3范围内（线性范围），避免过高浓度导致底物过早耗尽或反应非线性。
试剂稳定性： 葡萄糖溶液、显色试剂（尤其是OAB）需新鲜配制或妥善冷藏保存，避免失效。OAB见光易分解，需避光操作。
空白对照： 设置严格空白对照至关重要，应包含除酶以外所有反应组分（加等体积缓冲液替代酶液），以扣除试剂本底吸光度。
摩尔吸光系数： ε值需准确可靠。建议使用文献中经过验证的值，或自行使用已知浓度的H₂O₂标准品绘制标准曲线进行测定。
酶活性单位： 明确标示定义酶活力单位的具体条件（温度、pH、底物浓度）。
终止反应（若适用）： 终止液需能有效抑制酶活并使显色稳定。加入终止液后需充分混匀。
干扰物质： 样品中若存在高浓度的还原性物质（如抗坏血酸）、金属离子或其他可能影响GOD或POD活性的物质，可能会干扰结果，需考虑进行样品预处理或选用抗干扰方法。

六、其他检测方法

除了上述经典的比色法（终点法）外，GOD活性检测还可采用：

荧光法： 利用H₂O₂与荧光探针（如Amplex Red）在POD催化下生成强荧光产物进行检测，灵敏度更高。
氧气消耗法： 直接利用氧电极在线监测反应体系中溶解氧浓度的下降速率（Δ[O₂]/Δt），直接对应于GOD催化速率。此法无需偶联POD和显色剂。
电化学法： 基于酶电极或传感器，检测GOD催化反应产生的电流信号变化（通常与H₂O₂浓度相关）。常用于便携式或在线检测设备。

结论：

比色法（基于OAB/POD-H₂O₂显色体系）是测定葡萄糖氧化酶（GOD）活性的经典、可靠且广泛应用的方法。通过严格控制反应条件（温度、时间、底物浓度）、精确操作和合理计算，可以获得准确的酶活数据。理解检测原理和操作细节，并注意关键影响因素，是确保结果重现性和可靠性的关键。根据具体应用场景和精度要求，也可选用荧光法、氧电极法或电化学法等替代方案。