苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性检测

发布时间：2025-06-27 17:17:05 阅读量：3 作者：生物检测中心

苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性检测方法

一、 引言

苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia-lyase, PAL, EC 4.3.1.24)是苯丙烷代谢途径中的关键酶和限速酶，催化L-苯丙氨酸非氧化脱氨生成反式肉桂酸。该酶在植物生长发育、抗病防御反应（如植保素、木质素合成）、逆境胁迫响应以及次生代谢产物（如黄酮、花青素）的生物合成中扮演核心角色。准确测定PAL活性对于研究植物生理生化过程、抗性机制、代谢工程以及食品科学（如降低苯丙氨酸含量）等领域具有重要意义。本方法基于PAL催化产物反式肉桂酸在290 nm处的特征吸收，通过分光光度法测定其酶活性。

二、 检测原理

PAL催化以下反应：

L-苯丙氨酸 + H₂O → 反式肉桂酸 + NH₃

反应产物反式肉桂酸在紫外光区290 nm波长处具有最大吸收峰。在特定反应条件下（温度、pH、时间），酶活性与单位时间内生成的反式肉桂酸的量成正比，而反式肉桂酸的量与反应体系在290 nm处的吸光度增加值成正比。因此，通过测定反应体系在290 nm处吸光度随时间的变化，即可计算出PAL的酶活性。

三、 材料与试剂

  1. 酶源： 待测样品（如植物组织匀浆上清液、微生物粗提液或部分纯化酶液）。样品制备通常包括：组织在预冷的提取缓冲液（如0.1 M 硼酸钠缓冲液，pH 8.8，含5 mM β-巯基乙醇或DTT，1 mM EDTA，1% (w/v) PVP，1 mM PMSF）中冰浴研磨，离心（如4°C, 15,000 × g, 20 min），取上清液作为粗酶液。需预冷操作。
  2. 底物溶液： 20 mM L-苯丙氨酸溶液（溶解于0.1 M 硼酸钠缓冲液，pH 8.8）。用适量NaOH调节pH。
  3. 缓冲液： 0.1 M 硼酸钠缓冲液（Borax-NaOH），pH 8.8。
  4. 终止液： 1 M HCl。
  5. 标准品： 反式肉桂酸标准溶液（溶于0.1 M 硼酸钠缓冲液，pH 8.8），用于制作标准曲线（如0-100 μM）。
  6. 其他： 移液器及枪头、石英比色皿（光程1 cm）、恒温水浴锅、分光光度计、计时器、冰盒、离心机。
 

四、 操作步骤

  1. 标准曲线制作：

    • 配制一系列不同浓度（如0, 20, 40, 60, 80, 100 μM）的反式肉桂酸标准溶液（用0.1 M 硼酸钠缓冲液，pH 8.8配制）。
    • 取适量标准溶液（如1 mL）加入石英比色皿中。
    • 以缓冲液为空白对照，在290 nm波长下测定各标准溶液的吸光度值（A₂₉₀）。
    • 以反式肉桂酸浓度为横坐标（X），对应的A₂₉₀值为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得到线性回归方程（Y = kX + b）和消光系数（ε = k / 光程，单位通常为M⁻¹ cm⁻¹）。反式肉桂酸在pH 8.8，290 nm处的摩尔消光系数ε约为9,930 ± 300 M⁻¹ cm⁻¹（文献值，建议自行标定）。

  2. 酶反应体系建立：

    • 反应混合液： 在一个预冷的试管中加入：
      • 0.5 mL 0.1 M 硼酸钠缓冲液 (pH 8.8)
      • 0.5 mL 20 mM L-苯丙氨酸溶液
    • 将反应混合液置于恒温水浴锅（如37°C或30°C，根据研究需求设定）中预热5分钟。
    • 启动反应： 加入适量预冷的粗酶液（如0.1 mL，酶量需在检测线性范围内），立即混匀并开始计时。
    • 反应控制：
      • 样品管： 在设定的反应时间（如30分钟或60分钟）后，迅速加入0.1 mL 1 M HCl终止反应。
      • 空白对照管： 在加入酶液前先加入0.1 mL 1 M HCl终止潜在的非酶促反应，然后加入0.1 mL酶液，混匀后在相同温度下保温相同时间。此管用于扣除酶液中可能存在的干扰物质或底物本身的背景吸收。
      • 酶空白管： 在反应混合液中加入0.1 mL煮沸灭活的酶液（或缓冲液代替酶液），启动反应并保温相同时间后加入HCl终止。此管用于扣除反应体系中非酶促产生的背景吸收（通常较小，有时省略）。
    • 终止反应后，将各管混匀，室温静置片刻（如10分钟），确保产物稳定。

  3. 吸光度测定：

    • 将终止后的反应液转移至石英比色皿中（若浑浊需离心澄清）。
    • 以空白对照管（或酶空白管）的反应液作为参比（调零），在290 nm波长下测定样品管反应液的吸光度值（A<sub>样品</sub>）。
 

五、 结果计算

  1. 根据标准曲线计算：
    • 从标准曲线方程或根据A₂₉₀值查得对应的反式肉桂酸浓度（C<sub>产物</sub>，单位：μM 或 mol/L）。
    • 计算单位时间内生成的肉桂酸量：
      • 肉桂酸生成量（μmol）= C<sub>产物</sub> (μM) × 反应体系总体积 (L) × 1000
      • （反应体系总体积通常为1.1 mL = 0.0011 L）
  2. 根据消光系数计算：
    • 肉桂酸生成量（μmol）= (A<sub>样品</sub> - A<sub>空白</sub>) / (ε × d) × V × 1000
      • A<sub>样品</sub>：样品管在290 nm处的吸光度值
      • A<sub>空白</sub>：空白对照管在290 nm处的吸光度值（通常接近零，有时可忽略）
      • ε：反式肉桂酸在290 nm处的摩尔消光系数（M⁻¹ cm⁻¹），常用9900 M⁻¹ cm⁻¹（pH 8.8）或自行标定值
      • d：比色皿光程（cm），通常为1 cm
      • V：反应体系总体积（L），通常为0.0011 L（0.5 mL缓冲液 + 0.5 mL底物 + 0.1 mL酶液）
      • 1000：将mol转换为μmol的换算因子
  3. 计算酶活性：
    • 酶活性 (Units) = 肉桂酸生成量 (μmol) / 反应时间 (min)
    • 比活力 (Specific activity)： 通常表示为酶活性单位(U) / mg蛋白质。需同时测定酶液中蛋白质浓度（如Bradford法、Lowry法）。
    • 报告单位： 酶活性单位 (U) 定义为：在特定条件下（温度、pH），每分钟催化生成1 μmol反式肉桂酸所需的酶量。
    • 最终结果需注明测定条件（如温度、pH）。
 

六、 注意事项

  1. 温度控制： 酶反应对温度敏感，需确保水浴温度准确恒定，预热充分。加酶和终止反应操作要迅速。
  2. pH精确性： PAL活性对pH高度敏感，务必确保缓冲液和底物溶液的pH准确为8.8。
  3. 酶液稳定性： PAL易失活。样品制备全程需在冰浴中进行，尽快测定。必要时可加入甘油（终浓度10-20%）或BSA（0.1%）稳定酶活。
  4. 反应线性： 必须确保测定的吸光度变化在反应时间内呈线性增加。需进行预实验确定合适的酶液加入量和反应时间（通常控制在吸光度变化小于0.3/10 min）。
  5. 背景干扰： 粗酶液中可能含有在290 nm有吸收的杂质（如酚类），空白对照至关重要。必要时可进行透析或稀释。
  6. 底物浓度： 20 mM L-苯丙氨酸通常是饱和浓度（接近或超过Km值），确保反应在Vmax附近进行。必要时可验证。
  7. 仪器校准： 分光光度计需预热稳定，比色皿需洁净无痕。
  8. 重复性： 每个样品应设置至少2-3个重复，取平均值计算。
 

七、 应用与意义

本方法操作相对简便、成本较低、灵敏度满足常规研究需求，是实验室检测PAL活性的标准方法之一。广泛应用于：

  • 植物生理学与病理学： 研究植物在病原菌侵染、机械损伤、UV辐射、重金属、盐旱等胁迫下防御反应的启动与调控。
  • 次生代谢研究： 解析苯丙烷类代谢途径调控机制，评估代谢工程改造效果（如提高黄酮、花青素产量）。
  • 食品科学与营养： 筛选或改造低苯丙氨酸食品/饲料（如用于苯丙酮尿症患者），评估发酵食品中PAL活性。
  • 酶学性质研究： 测定酶的Km, Vmax, 最适pH/温度，抑制剂/激活剂效应等。
 

八、 常见问题

  1. 吸光值过高或过低： 调整酶液加入量或反应时间，确保在线性范围内。检查酶是否失活或底物是否失效。
  2. 标准曲线线性不佳： 检查标准品纯度、溶解度和配制准确性，确保仪器稳定。
  3. 空白值过高： 优化酶液制备方法（如增加离心力/时间、透析），或适当稀释酶液。检查缓冲液和底物纯度。
  4. 重现性差： 严格控制温度、时间、pH等条件的一致性，确保移液精确，充分混匀反应体系。
 

本方法提供了检测PAL活性的可靠框架，研究者可根据具体实验材料和目的进行适当优化（如缓冲液种类、pH、温度、反应时间等），并在报告中明确说明所用条件。