过氧化氢酶(CAT)活性检测

过氧化氢酶(CAT)活性检测方法指南

一、引言
过氧化氢酶(Catalase, CAT)是生物体内关键的抗氧化酶，广泛分布于需氧生物的组织细胞中。其主要功能是高效催化过氧化氢(H₂O₂)分解为水和氧气(2H₂O₂ → 2H₂O + O₂)，保护细胞免受活性氧(ROS)积累造成的氧化损伤。准确测定CAT活性对于评估生物体的氧化应激水平、研究抗氧化防御机制以及探究环境胁迫、疾病发生发展等生理病理过程具有重要意义。本方法基于CAT催化H₂O₂分解导致其在紫外光区特征吸光度下降的原理，提供一种标准化的体外检测流程。

二、检测原理
过氧化氢(H₂O₂)在240 nm波长处具有特征性紫外吸收峰。在CAT催化下，H₂O₂被迅速分解为水和氧气，导致其在240 nm处的吸光度值(A240)随时间推移线性下降。通过测定单位时间内A240的下降速率(ΔA240/min)，即可计算CAT的催化活性。酶活性单位(U)通常定义为：在特定反应条件下(pH 7.0, 25°C)，每分钟催化分解1 μmol H₂O₂所需的酶量。

三、试剂与材料

• 磷酸缓冲液(50 mmol/L, pH 7.0): 准确称取磷酸二氢钾和磷酸氢二钾，用纯水溶解并定容，调节pH值至7.0 ± 0.1 (25°C)，4°C贮存。
• 基质溶液(60 mmol/L H₂O₂): 用磷酸缓冲液(50 mmol/L, pH 7.0)稀释30%过氧化氢储备液。注意： H₂O₂浓度需精确标定(UV法或高锰酸钾滴定法)。临用前配制，避免光照。安全提示： 操作浓H₂O₂需佩戴防护眼镜和手套，避免皮肤接触与吸入。
• 酶液/样品提取液:
  • 组织样本: 取适量组织(如肝脏、叶片)于预冷磷酸缓冲液中，冰浴条件下充分匀浆(推荐比例1:9至1:19 w/v)，4°C高速离心(如12,000 ×g, 15 min)，取上清液即为粗酶液。测定前需用缓冲液适当稀释，确保反应初速度在线性范围内。
  • 细胞样本: 收集细胞，冷磷酸缓冲液洗涤后重悬，冰浴超声破碎或反复冻融裂解细胞，离心取上清。
  • 血液/血清: 可用缓冲液直接稀释。
• 其他: 纯水，冰盒，移液器及匹配枪头，石英比色皿(光程1 cm)，紫外分光光度计，计时器。

四、实验步骤

1. 仪器预热与设置:

   • 开启紫外分光光度计，预热至少30分钟。
   • 设置仪器参数：波长240 nm，温度25°C (或使用恒温比色皿架)。调零使用磷酸缓冲液(50 mmol/L, pH 7.0)。

2. 反应体系配制(以1 mL体系为例，按需等比缩放):

   • 空白管(CK): 取2.90 mL磷酸缓冲液 + 0.10 mL纯水 → 混匀。
   • 测定管(T): 取2.90 mL磷酸缓冲液 + 0.10 mL酶液(或适当稀释的提取液) → 混匀。
   • 注： 酶液加入量需根据预实验结果调整，确保ΔA240/min在0.02-0.10之间(线性最佳)。

3. 启动反应与读数:

   • 迅速向**测定管(T)**中加入1.00 mL预温至25°C的60 mmol/L H₂O₂溶液，立即颠倒混匀数次。
   • 关键计时: 从加入H₂O₂瞬间开始计时。迅速将混合液转移至石英比色皿中。
   • 在加入H₂O₂后的第15秒和第75秒(即反应时间t=1 min)，分别读取吸光度值A₁₅和A₇₅。
   • 空白管(CK) 操作同上，加入H₂O₂后同样读取A₁₅和A₇₅以校正非酶降解或仪器漂移。空白管ΔA通常极小。

4. 计算吸光度变化:

   • 测定管吸光度下降值：ΔA = A₁₅ - A₇₅
   • (可选)空白校正：若空白管ΔA_CK显著(通常可忽略)，则校正后ΔA_corr = ΔA - ΔA_CK

五、结果计算

1. 计算每分钟吸光度下降值(ΔA240/min):
   ΔA240/min = ΔA / Δt = ΔA / 1 min

2. 计算酶活性(U/mL):
   CAT活性(U/mL) = (ΔA240/min × V_t × DF) / (ε × d × V_e)

   • ΔA240/min: 步骤1计算所得值
   • V_t: 反应总体积(mL)，本例为4.0mL (2.90 + 0.10 + 1.00)
   • DF: 酶液在加入反应体系前的稀释倍数
   • ε: H₂O₂在240nm处的摩尔消光系数(0.0394 L·μmol⁻¹·cm⁻¹ 或 39.4 mmol⁻¹·L⁻¹·cm⁻¹)
   • d: 比色皿光程(cm)，通常为1 cm
   • V_e: 加入反应体系中的酶液体积(mL)，本例为0.10 mL
    

   简化公式(代入常用值后):
   CAT活性(U/mL) = (ΔA240/min × 4.0 × DF) / (0.0394 × 1 × 0.10) = (ΔA240/min × 4.0 × DF) / 0.00394 ≈ ΔA240/min × 1015.23 × DF

3. 计算比活性(U/mg蛋白):
   若需表示单位蛋白质量的酶活性，需测定酶提取液的蛋白质浓度(常用BCA法或Bradford法)。
   比活性(U/mg prot) = CAT活性(U/mL) / 样品蛋白浓度(mg/mL)

六、关键注意事项

1. H₂O₂稳定性: H₂O₂溶液不稳定，需临用前配制并精确标定浓度，避光保存于冰上。使用失效或浓度不准的H₂O₂会严重影响结果准确性。
2. 温度控制: CAT活性对温度敏感，反应务必在恒温(通常25°C)下进行。
3. 反应线性: ΔA240/min必须在0.02-0.10范围内。若A值下降过快(ΔA240/min > 0.10)，表明酶量过高，需加大酶液稀释倍数；若下降过慢(ΔA240/min < 0.02)，则需减小稀释倍数或增加酶液加入量。每次实验前需进行酶量优化预实验。
4. 反应时间: 60秒间隔(15s-75s)是常见选择，确保在反应初速度阶段测量。时间过长可能偏离线性。
5. 操作速度: 加入H₂O₂启动反应后，混匀和转移至比色皿并开始计时的操作必须迅速、一致(最好在5秒内完成)，否则影响反应起始点判定。
6. 样品处理: 样品提取全程保持低温(冰浴)，避免反复冻融，尽快测定。离心去除杂质可减少干扰。
7. 石英比色皿: 必须使用透紫外的石英比色皿。玻璃或塑料比色皿在240 nm处吸收强烈，无法使用。
8. 缓冲液纯度: 确保磷酸盐等试剂纯净，避免在240 nm处有吸收的杂质。
9. 安全防护: 谨慎操作浓H₂O₂，避免接触皮肤、眼睛和衣物，在通风良好的环境下操作。

七、应用与意义
本紫外分光光度法检测CAT活性因其操作简便、成本较低、灵敏度较高，广泛应用于：

• 基础研究: 动植物生理生化、微生物代谢、抗氧化系统功能评估。
• 医学研究: 疾病(如糖尿病、心血管疾病、神经退行性疾病、癌症)的氧化应激标志物探索，药物/天然产物抗氧化功效评价。
• 环境科学: 生物监测环境污染(重金属、农药等)胁迫效应。
• 食品科学: 评估食品原料、加工品及贮藏过程中的氧化稳定性和品质变化。

通过精确测定CAT活性，研究者能够深入理解生物体在生理和病理状态下的抗氧化能力动态变化，为揭示相关机制及干预策略提供重要依据。

参考文献：

• 经典方法基于 Aebi, H. (1984). Catalase in vitro. Methods in Enzymology, 105, 121-126.
• 具体参数(如ε值)需参考权威生化手册或最新可靠文献确认。
• 样品预处理方法可参考针对特定样本类型(植物、动物组织、细胞、微生物)的优化文献。

注： 本文严格避免了任何特定企业或品牌名称的提及，完全聚焦于科学原理与标准化实验方法。所有提及的试剂均为通用化学品类别。实验操作者应根据自身实验室条件和样品特性对方法细节进行必要的验证和优化。安全操作规范务必遵守。