脯氨酸(PRO)含量检测

脯氨酸（PRO）含量检测方法

一、 引言

脯氨酸（Proline, Pro）是一种重要的环状亚氨基酸，在生物体中发挥着多种关键生理作用。它是植物体内最主要的渗透调节物质之一，在干旱、盐碱、低温等逆境条件下，植物细胞会大量积累脯氨酸以维持渗透平衡、稳定蛋白质结构和清除活性氧。此外，脯氨酸也参与人体胶原蛋白合成、抗氧化防御、神经递质调节等过程。因此，精确测定生物样品（尤其是植物组织）中的脯氨酸含量，对于研究植物抗逆生理、人体营养与代谢、食品品质评价等领域具有重要意义。

二、 检测原理

本方法基于经典的酸性茚三酮比色法，其核心反应步骤如下：

1. 样品提取与纯化： 使用水溶性有机溶剂（通常是乙醇或甲醇）提取组织中的游离脯氨酸，并通过离心或过滤去除大分子杂质（如蛋白质、多糖）。
2. 磺基水杨酸处理： 加入磺基水杨酸溶液进一步沉淀残留的蛋白质，确保后续反应特异性。
3. 酸性茚三酮显色反应： 在强酸性（常用冰醋酸）、高温（通常在沸水浴中进行）条件下，提取液中的脯氨酸与茚三酮试剂发生特异性反应，生成一种稳定的、在特定波长（通常为520 nm）处有最大吸收的红色化合物（Proline-ninhydrin complex）。
4. 比色测定： 反应完成后，加入甲苯萃取红色产物至有机相，分离后利用分光光度计或酶标仪测定有机相在520 nm波长处的吸光度值（OD520）。该吸光度值与样品中的脯氨酸含量在一定范围内呈良好的线性关系。

三、 所需仪器与试剂

• 主要仪器：
  • 高速冷冻离心机
  • 分光光度计或酶标仪 (配备520 nm滤光片)
  • 恒温水浴锅 (沸水浴)
  • 振荡器 (漩涡混合器)
  • 精密天平 (感量0.0001 g)
  • 移液器 (不同量程)
  • 试管架、离心管（10-15 mL）、玻璃试管（具塞）、比色皿（石英或玻璃）或酶标板
  • 研钵或组织研磨器
• 主要试剂 (均为分析纯)：
  • 提取液： 70-80% (v/v) 乙醇水溶液 或 无水甲醇（用于提取游离脯氨酸）
  • 磺基水杨酸溶液： 3% (w/v) 磺基水杨酸水溶液 (沉淀蛋白质)
  • 冰醋酸 (Glacial Acetic Acid)： (提供酸性反应环境)
  • 茚三酮显色液： 2.5% (w/v) 茚三酮溶解于预热至70°C的60% (v/v) 冰醋酸水溶液和40% (v/v) 6 M 磷酸的混合液中（临用前配制，避免光照。注意：操作磷酸需小心，具有腐蚀性）
  • 甲苯 (Toluene)： (用于萃取红色产物)
  • 脯氨酸标准品： L-脯氨酸 (用于绘制标准曲线)
  • 超纯水

四、 操作步骤

1. 样品制备：

   • 取新鲜植物组织（如叶片），迅速用液氮冷冻，然后转移至-80°C或-20°C冰箱保存备用。
   • 准确称取一定量（如0.1-0.5 g）冷冻组织于研钵中，加入少量石英砂和适量预冷的提取液（70-80%乙醇），在冰浴条件下充分研磨成匀浆。
   • 将匀浆转移至离心管中，用适量提取液冲洗研钵并入离心管，定容至一定体积（如5 mL或10 mL）。
   • 将离心管置于80°C水浴中保温20分钟（或室温下振荡提取一段时间，如1小时），期间不时振荡。
   • 离心： 冷却后，于4°C、10,000 - 12,000 rpm下离心10-15分钟。
   • 取上清： 小心吸取上清液备用（此即脯氨酸粗提液）。

2. 蛋白质沉淀：

   • 取一定体积（如1 mL）的脯氨酸粗提液，加入等体积的3%磺基水杨酸溶液，充分混匀。
   • 室温静置10分钟或4°C放置更长时间（如30分钟）。
   • 离心： 于室温或4°C、10,000 rpm下离心10分钟。
   • 取上清： 小心吸取上清液备用（此即纯化的脯氨酸提取液）。

3. 茚三酮显色反应：

   • 取一定体积（如1 mL）的纯化提取液（或稀释后的提取液）于具塞玻璃试管中（注意：反应在酸性高温下进行，需使用耐热耐腐蚀的玻璃容器）。
   • 加入1 mL冰醋酸和1 mL 新配制的2.5%酸性茚三酮显色液，盖紧塞子，充分混匀。
   • 沸水浴反应： 将试管置于沸水浴中，精确计时加热40分钟（反应时间需严格控制）。
   • 终止与冷却： 反应结束后，迅速将试管移入冰水浴中冷却5-10分钟，终止反应。

4. 产物萃取：

   • 向冷却后的反应体系中加入4 mL甲苯。
   • 盖紧塞子，用力振荡试管15-20秒，使红色的脯氨酸-茚三酮复合物充分萃取到甲苯层中。
   • 静置分层： 将试管静置于室温避光处，直至甲苯层（上层红色）和水层（下层无色或淡黄色）完全清晰分层（通常需要15-30分钟）。

5. 比色测定：

   • 小心吸取甲苯层（上层红色有机相），避免吸入水层，注入干净的比色皿或酶标板孔中。
   • 以甲苯作为空白对照，在520 nm波长处测定吸光度值（OD520）。

6. 标准曲线绘制：

   • 精确称取L-脯氨酸标准品，用超纯水溶解配制成一定浓度的母液（如1 mg/mL）。
   • 将母液梯度稀释成一系列不同浓度的标准溶液（如0、5、10、20、40、60、80、100 μg/mL）。
   • 取各浓度标准溶液1 mL（相当于0-100 μg脯氨酸），严格依照步骤3、4、5进行显色、萃取和比色测定（即代替样品提取液参与反应）。
   • 以脯氨酸含量（μg）或浓度（μg/mL）为横坐标（X），对应的OD520值为纵坐标（Y），绘制标准曲线。标准曲线应呈现良好的线性关系（线性回归方程 Y = aX + b， R² > 0.99）。

五、 结果计算

根据测得的样品OD520值，从标准曲线上查得对应的脯氨酸含量（μg），然后根据取样量、提取液体积、测定时所用提取液体积等换算成样品中脯氨酸的含量。

计算公式通常表示为：

脯氨酸含量 (μg/g 鲜重) = [(C * Vt) / (Vs * W)] * n

• C： 从标准曲线上查得的测定液（即参与显色反应的纯化提取液）中脯氨酸浓度 (μg/mL)。
• Vt： 样品总提取液体积 (mL)。
• Vs： 参与显色反应的纯化提取液体积 (mL)。
• W： 样品鲜重 (g)。
• n： 稀释倍数（如果在显色前对纯化提取液进行了稀释）。

示例计算：
假设：

• 称取鲜样重 (W) = 0.2 g
• 总提取液体积 (Vt) = 10 mL
• 取纯化提取液体积 (Vs) = 1 mL 进行显色反应
• 测得 OD520，查标准曲线得测定液浓度 (C) = 25 μg/mL
• 无稀释 (n = 1)

则脯氨酸含量 = [(25 μg/mL * 10 mL) / (1 mL * 0.2 g)] * 1 = 1250 μg/g 鲜重

六、 注意事项

1. 样品代表性： 选取的植物组织应具有代表性，且取样后需立即冷冻以终止酶活，防止脯氨酸代谢影响结果。
2. 提取充分性： 研磨需充分，确保游离脯氨酸完全释放。提取温度和时间根据样品类型可适当调整优化。
3. 蛋白质沉淀： 磺基水杨酸沉淀蛋白质步骤对消除干扰、提高特异性至关重要，不可省略。
4. 茚三酮试剂： 需严格按比例和温度配制，临用新配，避免光照。磷酸具有强腐蚀性，配制和取用需极其小心，佩戴防护装备。
5. 反应条件控制： 沸水浴反应时间和温度必须严格控制，这是显色稳定性和重现性的关键。
6. 萃取与分层： 加入甲苯后需充分振荡确保萃取完全，并耐心等待清晰分层后方可取上层甲苯相测定，避免吸入水相导致误差。
7. 比色测定： 甲苯易挥发，萃取后应尽快测定吸光度。比色皿需保持清洁干燥。避免气泡影响读数。
8. 标准曲线： 每次实验必须随样品同时制作新鲜的标准曲线。
9. 安全防护： 实验涉及冰醋酸、甲苯、磷酸等有毒、腐蚀性或易燃试剂，务必在通风橱内操作，佩戴实验服、手套、护目镜等防护用品。废液按规范处理。
10. 重复与对照： 每个样品应设置至少2-3个重复，并设置试剂空白（用超纯水代替样品液按同样步骤操作）以扣除背景值。

七、 方法特点与应用

• 优点：
  • 特异性较好： 在酸性条件下，脯氨酸与茚三酮反应生成的红色产物与其他氨基酸生成的蓝色产物区分开。
  • 灵敏度适中： 可检测μg/g鲜重水平的脯氨酸。
  • 成本较低： 所用试剂和仪器在大多数实验室都具备。
  • 操作相对成熟： 是广泛使用的经典方法。
• 局限性：
  • 步骤较繁琐： 涉及提取、沉淀、显色、萃取等多个步骤，耗时较长。
  • 干扰因素： 某些样品中的杂质（如糖类、某些色素）在高浓度时可能产生干扰。
  • 使用有毒试剂： 甲苯、冰醋酸、茚三酮等需谨慎处理。
• 主要应用领域：
  • 植物抗逆生理研究（干旱、盐胁迫、低温等条件下脯氨酸积累动态）。
  • 作物品种改良（筛选高脯氨酸积累的抗逆种质）。
  • 食品科学（果蔬贮藏保鲜过程中品质变化研究）。
  • 基础生物化学与分子生物学研究（脯氨酸代谢途径分析）。

八、 参考文献 (示例)

1. Bates, L. S., Waldren, R. P., & Teare, I. D. (1973). Rapid determination of free proline for water-stress studies. Plant and Soil, 39(1), 205–207. (经典原始文献)
2. Ștefan, M., & Petrescu, S. (2018). Spectrophotometric Determination of Proline in Plant Tissues. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.), 1734, 155–161. (详细操作指南)
3. 李合生 主编. (2000). 植物生理生化实验原理和技术. 高等教育出版社. (中文经典参考书中包含该方法)
4. 王学奎 主编. (2016). 植物生理生化实验原理和技术（第3版）. 高等教育出版社. (中文最新版参考书)

通过遵循以上详细的操作步骤和注意事项，研究人员可以准确、可靠地测定各类生物样品（尤其是植物组织）中的脯氨酸含量，为相关研究提供重要的生理生化指标数据。