线粒体呼吸链复合体Ⅱ活性检测

发布时间：2025-06-27 16:50:58 阅读量：3 作者：生物检测中心

线粒体呼吸链复合体Ⅱ活性检测技术指南

一、 引言

线粒体呼吸链复合体Ⅱ（琥珀酸脱氢酶，Succinate Dehydrogenase，SDH；或琥珀酸：泛醌氧化还原酶，Succinate:ubiquinone oxidoreductase，SQR），是连接三羧酸循环（TCA循环）与氧化磷酸化（OXPHOS）的关键节点。它催化琥珀酸氧化为延胡索酸，并将释放的电子经其辅基FAD传递给泛醌（辅酶Q）。复合体Ⅱ自身不泵出质子，不直接贡献于跨膜质子梯度的建立，其功能异常与多种疾病（如神经退行性疾病、癌症、心肌缺血等）及衰老过程密切相关。因此，准确检测复合体Ⅱ的活性对于研究能量代谢、疾病机制和药物筛选至关重要。

二、 检测原理

复合体Ⅱ的核心功能是催化琥珀酸脱氢氧化并将电子传递给泛醌。基于此，其活性检测主要依赖两类方法：

  1. 天然电子传递途径检测（琥珀酸→泛醌）：
    • 原理： 以琥珀酸为底物，监测其氧化过程中电子传递至人工电子受体（替代泛醌）引起的吸光度变化。
    • 常用电子受体： 2, 6-二氯酚靛酚（DCPIP）。DCPIP在还原态（无色）和氧化态（蓝色）之间转变。
    • 反应体系：
      • 底物： 琥珀酸钠 (Succinate)
      • 电子受体： DCPIP
      • 抑制剂（可选）： 丙二酸 (Malonate)，作为琥珀酸的结构类似物竞争性抑制复合体Ⅱ活性，用于验证反应特异性。
      • 辅助试剂： 叠氮化钠 (NaN₃) 或抗霉素 A (Antimycin A) - 抑制复合体Ⅳ或Ⅲ，防止电子回流干扰；氰化钾 (KCN) 也可用于抑制细胞色素c氧化酶（复合体Ⅳ）。
    • 检测方法： 分光光度法。监测DCPIP在600 nm波长处吸光度（A600）的下降速率。DCPIP被还原得越多（蓝色变浅），吸光度下降越快，表明复合体Ⅱ活性越高。
    • 反应式简化：
  
 
 
 
琥珀酸 + DCPIP(ox) → 延胡索酸 + DCPIP(red)
 
 
 
(其中ox为氧化态，red为还原态)

2. 人工电子受体直接检测（琥珀酸→人工染料）：
* 原理： 利用复合体Ⅱ的内在酶活性，直接将电子传递给特定的人工染料（如铁氰化钾），避免使用泛醌类似物。
* 常用电子受体： 铁氰化钾（K₃[Fe(CN)₆]， Potassium ferricyanide）。黄色的铁氰化钾被还原成无色的亚铁氰化钾。
* 检测方法： 分光光度法。监测铁氰化钾在420 nm波长处吸光度（A420）的下降速率。吸光度下降速率反映复合体Ⅱ活性。
* 反应式简化：

 
 
 
琥珀酸 + 2[Fe(CN)₆]³⁻ → 延胡索酸 + 2[Fe(CN)₆]⁴⁻

三、 实验材料与方法

  1. 样品制备：

    • 来源： 新鲜或速冻的组织（如肝脏、肌肉、心脏、脑）、培养的细胞、分离的线粒体。
    • 匀浆缓冲液： 通常含蔗糖（~250 mM）、HEPES或Tris-HCl（pH 7.2-7.4）、EDTA或EGTA（鳌合金属离子）。保持等渗和适宜pH，避免蛋白酶降解（可加蛋白酶抑制剂）。预冷（0-4°C）操作。
    • 破碎方法： 根据样品选择合适的匀浆器（如玻璃匀浆器、聚四氟乙烯匀浆器、超声破碎仪）。组织需剪碎后匀浆；细胞可通过反复冻融、低渗裂解或温和匀浆破碎。
    • 离心： 低速离心（如600-1000 g， 4°C， 10 min）去除细胞核、未破碎细胞和碎片。收集上清液用于后续实验（此为粗线粒体组分）。为获得更纯的线粒体，需进一步高速离心（如10, 000-12, 000 g， 4°C， 10-15 min），沉淀即为线粒体组分，用匀浆缓冲液或特定悬浮缓冲液（如含牛血清白蛋白BSA保护）重悬。蛋白浓度测定（如BCA法、Bradford法）以标准化活性。

  2. 反应体系（以DCPIP法为例）：

    • 反应缓冲液 (终浓度)：
      • KPi 缓冲液 (pH 7.4-7.8)： 25-50 mM
      • 琥珀酸钠： 20-50 mM (饱和浓度)
      • NaN₃ 或 KCN： 1-2 mM (抑制复合体Ⅳ)
      • 抗霉素 A： 2-10 μM (抑制复合体Ⅲ，阻断电子回流)
      • EDTA： 0.1-1 mM (鳌合剂)
      • DCPIP： 50-100 μM (工作浓度，需避光保存配制)
    • 反应体积： 通常 1 mL (适用于1 cm光径比色皿)。
    • 温度： 通常 25°C 或 30°C (需恒温控制)。
    • 操作步骤：
      1. 将预热至反应温度的缓冲液（含抑制剂、EDTA）加入比色皿。
      2. 加入适量样品（线粒体悬液/组织匀浆上清液，含一定量蛋白，如10-50 μg）。
      3. 加入DCPIP（避光操作），混匀。
      4. 立即放入分光光度计比色槽中，设定波长600 nm，记录初始吸光度。
      5. 加入底物琥珀酸钠启动反应（加入体积小，确保快速混匀）。
      6. 连续监测A600下降至少2-5分钟，记录线性下降阶段的斜率。

  3. 对照设置：

    • 空白对照： 不含样品的完整反应体系（含所有试剂）。用于校正背景变化。
    • 特异性抑制对照： 加入竞争性抑制剂丙二酸钠（终浓度5-20 mM）预孵育样品几分钟，再加入琥珀酸启动反应。此反应速率应显著低于正常反应速率（通常被抑制>80%），证明检测到的活性主要源于复合体Ⅱ。

  4. 结果计算：

    • 计算样品反应速率（ΔA600/min）和空白对照速率（ΔA600_blank/min）。
    • 复合体Ⅱ活性 (nmol/min/mg prot) =
      [ (ΔA600_sample/min - ΔA600_blank/min) * V * 1000 ] / (ε * d * C)
    • 参数说明：
      • ΔA600_sample/min： 样品反应线性下降阶段的斜率（吸光度变化率/分钟）。
      • ΔA600_blank/min： 空白对照的斜率（吸光度变化率/分钟）。
      • V： 反应体系总体积 (mL)。
      • 1000： 单位转换系数（nmol）。
      • ε： DCPIP在600 nm处的摩尔消光系数（通常采用21.8 mM⁻¹ cm⁻¹ 或 2.18 × 10⁴ M⁻¹ cm⁻¹）。 （务必确认所用DCPIP在特定反应条件下的ε值，不同文献/批次可能略有差异）
      • d： 比色皿光径 (cm，通常为1 cm)。
      • C： 样品中蛋白质浓度 (mg/mL)。
    • 单位： 活性通常表示为每分钟每毫克蛋白还原DCPIP的纳摩尔数 (nmol/min/mg prot)。
 

四、 关键注意事项与优化策略

  1. 样品质量： 新鲜样品或妥善保存（-80°C速冻）的样品最佳。反复冻融会显著降低酶活性。匀浆过程需快速、低温、温和，避免过度剪切破坏线粒体结构。蛋白浓度过高可能导致非线性反应。
  2. 抑制剂有效性： 确保NaN₃/KCN、抗霉素A有效抑制下游复合体，防止电子通过其他途径传递导致背景升高。加入抑制剂后孵育足够时间（如5 min）。丙二酸抑制对照是验证反应特异性的关键。
  3. 反应线性： 确保监测的是反应初始线性阶段（通常前1-3分钟），此时底物浓度远高于酶浓度，反应速率恒定（零级反应）。反应时间过长会因底物消耗、产物抑制或酶失活导致非线性。
  4. DCPIP稳定性： DCPIP溶液需新鲜配制并避光保存。其还原反应对光敏感，操作和检测时应尽量避光。其消光系数需准确。
  5. 底物浓度： 使用饱和浓度的琥珀酸（通常20-50 mM）以确保酶被完全饱和。过低浓度会限制反应速率。
  6. pH与温度： 精确控制反应缓冲液的pH（通常7.4-7.8）和反应温度（25°C或30°C），因酶活性对此敏感。
  7. 浊度影响： 样品（尤其是组织匀浆）可能引入浊度，干扰吸光度读数。确保样品充分破碎并离心去除不溶物。空白对照可部分抵消浊度影响。
  8. 酶稀释度： 如果初始速率太快导致线性阶段太短，可稀释样品；反之速率太低则增加样本量或蛋白浓度。
  9. 替代方法： 铁氰化钾法（420 nm检测）在某些情况下更稳定、背景更低，且避免了DCPIP的光敏感性。但需注意铁氰化钾对某些酶有抑制作用。
 

五、 应用领域

复合体Ⅱ活性检测广泛应用于：

  • 基础研究： 探究能量代谢调控机制、线粒体功能、衰老生物学。
  • 疾病机制研究： 评估神经退行性疾病（帕金森病、阿尔茨海默病）、心血管疾病（心肌缺血再灌注损伤、心力衰竭）、代谢性疾病（糖尿病、肥胖）、癌症等中线粒体功能障碍的程度。
  • 药物/毒理学研究： 筛选靶向线粒体能量代谢的药物（如抗肿瘤药、神经保护剂），评估环境毒素或药物对线粒体的毒性作用。
  • 遗传学研究： 确定编码复合体Ⅱ亚基基因突变（如SDHA, SDHB, SDHC, SDHD）导致的致病机制（如副神经节瘤、嗜铬细胞瘤、Leigh综合征等）。
 

六、 总结

线粒体呼吸链复合体Ⅱ（琥珀酸脱氢酶）活性检测是评估线粒体功能的核心手段之一。基于分光光度法的DCPIP还原法是最常用的方法，原理清晰，操作相对简便。实验成功的关键在于确保样品活性完好、反应条件优化（底物饱和、抑制剂有效、pH/温度准确）、严格设置对照（特别是丙二酸抑制对照以验证特异性），并对数据进行正确的计算。铁氰化钾还原法是另一种可靠的选择。严格遵守实验细节和注意事项，能够获得可靠、可重复的复合体Ⅱ活性数据，为深入理解能量代谢及相关疾病的生理病理机制提供重要依据。

参考文献 (示例格式，请根据实际引用文献)

  1. Birch-Machin, M. A., & Turnbull, D. M. (2001). Assaying mitochondrial respiratory complex activity in mitochondria isolated from human cells and tissues. Methods in Cell Biology, 65, 97–117.
  2. Spinazzi, M., Casarin, A., Pertegato, V., Salviati, L., & Angelini, C. (2012). Assessment of mitochondrial respiratory chain enzymatic activities on tissues and cultured cells. Nature Protocols, 7(6), 1235–1246.
  3. Janssen, A. J., Trijbels, F. J., Sengers, R. C., Smeitink, J. A., van den Heuvel, L. P., Wintjes, L. T., ... & Rodenburg, R. J. (2007). Spectrophotometric assay for complex I of the respiratory chain in tissue samples and cultured fibroblasts. Clinical Chemistry, 53(4), 729–734. (Protocols often include SDH/complex II).
  4. Kirby, D. M., Thorburn, D. R., Turnbull, D. M., & Taylor, R. W. (2007). Biochemical assays of respiratory chain complex activity. Methods in Cell Biology, 80, 93–119.
  5. Trounce, I. A., Kim, Y. L., Jun, A. S., & Wallace, D. C. (1996). Assessment of mitochondrial oxidative phosphorylation in patient muscle biopsies, lymphoblasts, and transmitochondrial cell lines. Methods in Enzymology, 264, 484–509.