线粒体呼吸链复合体Ⅱ活性检测

发布时间：2025-06-27 16:50:58 阅读量：2 作者：生物检测中心

线粒体呼吸链复合体Ⅱ活性检测技术指南

一、 引言

线粒体呼吸链复合体Ⅱ（琥珀酸脱氢酶，Succinate Dehydrogenase，SDH；或琥珀酸：泛醌氧化还原酶，Succinate:ubiquinone oxidoreductase，SQR），是连接三羧酸循环（TCA循环）与氧化磷酸化（OXPHOS）的关键节点。它催化琥珀酸氧化为延胡索酸，并将释放的电子经其辅基FAD传递给泛醌（辅酶Q）。复合体Ⅱ自身不泵出质子，不直接贡献于跨膜质子梯度的建立，其功能异常与多种疾病（如神经退行性疾病、癌症、心肌缺血等）及衰老过程密切相关。因此，准确检测复合体Ⅱ的活性对于研究能量代谢、疾病机制和药物筛选至关重要。

二、 检测原理

复合体Ⅱ的核心功能是催化琥珀酸脱氢氧化并将电子传递给泛醌。基于此，其活性检测主要依赖两类方法：

  1. 天然电子传递途径检测（琥珀酸→泛醌）：
    • 原理： 以琥珀酸为底物，监测其氧化过程中电子传递至人工电子受体（替代泛醌）引起的吸光度变化。
    • 常用电子受体： 2, 6-二氯酚靛酚（DCPIP）。DCPIP在还原态（无色）和氧化态（蓝色）之间转变。
    • 反应体系：
      • 底物： 琥珀酸钠 (Succinate)
      • 电子受体： DCPIP
      • 抑制剂（可选）： 丙二酸 (Malonate)，作为琥珀酸的结构类似物竞争性抑制复合体Ⅱ活性，用于验证反应特异性。
      • 辅助试剂： 叠氮化钠 (NaN₃) 或抗霉素 A (Antimycin A) - 抑制复合体Ⅳ或Ⅲ，防止电子回流干扰；氰化钾 (KCN) 也可用于抑制细胞色素c氧化酶（复合体Ⅳ）。
    • 检测方法： 分光光度法。监测DCPIP在600 nm波长处吸光度（A600）的下降速率。DCPIP被还原得越多（蓝色变浅），吸光度下降越快，表明复合体Ⅱ活性越高。
    • 反应式简化：
  
 
 
 
琥珀酸 + DCPIP(ox) → 延胡索酸 + DCPIP(red)
 
 
 
(其中ox为氧化态，red为还原态)

2. 人工电子受体直接检测（琥珀酸→人工染料）：
* 原理： 利用复合体Ⅱ的内在酶活性，直接将电子传递给特定的人工染料（如铁氰化钾），避免使用泛醌类似物。
* 常用电子受体： 铁氰化钾（K₃[Fe(CN)₆]， Potassium ferricyanide）。黄色的铁氰化钾被还原成无色的亚铁氰化钾。
* 检测方法： 分光光度法。监测铁氰化钾在420 nm波长处吸光度（A420）的下降速率。吸光度下降速率反映复合体Ⅱ活性。
* 反应式简化：

 
 
 
琥珀酸 + 2[Fe(CN)₆]³⁻ → 延胡索酸 + 2[Fe(CN)₆]⁴⁻

三、 实验材料与方法

  1. 样品制备：

    • 来源： 新鲜或速冻的组织（如肝脏、肌肉、心脏、脑）、培养的细胞、分离的线粒体。
    • 匀浆缓冲液： 通常含蔗糖（~250 mM）、HEPES或Tris-HCl（pH 7.2-7.4）、EDTA或EGTA（鳌合金属离子）。保持等渗和适宜pH，避免蛋白酶降解（可加蛋白酶抑制剂）。预冷（0-4°C）操作。
    • 破碎方法： 根据样品选择合适的匀浆器（如玻璃匀浆器、聚四氟乙烯匀浆器、超声破碎仪）。组织需剪碎后匀浆；细胞可通过反复冻融、低渗裂解或温和匀浆破碎。
    • 离心： 低速离心（如600-1000 g， 4°C， 10 min）去除细胞核、未破碎细胞和碎片。收集上清液用于后续实验（此为粗线粒体组分）。为获得更纯的线粒体，需进一步高速离心（如10, 000-12, 000 g， 4°C， 10-15 min），沉淀即为线粒体组分，用匀浆缓冲液或特定悬浮缓冲液（如含牛血清白蛋白BSA保护）重悬。蛋白浓度测定（如BCA法、Bradford法）以标准化活性。

  2. 反应体系（以DCPIP法为例）：

    • 反应缓冲液 (终浓度)：
      • KPi 缓冲液 (pH 7.4-7.8)： 25-50 mM
      • 琥珀酸钠： 20-50 mM (饱和浓度)
      • NaN₃ 或 KCN： 1-2 mM (抑制复合体Ⅳ)
      • 抗霉素 A： 2-10 μM (抑制复合体Ⅲ，阻断电子回流)
      • EDTA： 0.1-1 mM (鳌合剂)
      • DCPIP： 50-100 μM (工作浓度，需避光保存配制)
    • 反应体积： 通常 1 mL (适用于1 cm光径比色皿)。
    • 温度： 通常 25°C 或 30°C (需恒温控制)。
    • 操作步骤：
      1. 将预热至反应温度的缓冲液（含抑制剂、EDTA）加入比色皿。
      2. 加入适量样品（线粒体悬液/组织匀浆上清液，含一定量蛋白，如10-50 μg）。
      3. 加入DCPIP（避光操作），混匀。
      4. 立即放入分光光度计比色槽中，设定波长600 nm，记录初始吸光度。
      5. 加入底物琥珀酸钠启动反应（加入体积小，确保快速混匀）。
      6. 连续监测A600下降至少2-5分钟，记录线性下降阶段的斜率。

  3. 对照设置：

    • 空白对照： 不含样品的完整反应体系（含所有试剂）。用于校正背景变化。
    • 特异性抑制对照： 加入竞争性抑制剂丙二酸钠（终浓度5-20 mM）预孵育样品几分钟，再加入琥珀酸启动反应。此反应速率应显著低于正常反应速率（通常被抑制>80%），证明检测到的活性主要源于复合体Ⅱ。

  4. 结果计算：

    • 计算样品反应速率（ΔA600/min）和空白对照速率（ΔA600_blank/min）。
    • 复合体Ⅱ活性 (nmol/min/mg prot) =
      [ (ΔA600_sample/min - ΔA600_blank/min) * V * 1000 ] / (ε * d * C)
    • 参数说明：
      • ΔA600_sample/min： 样品反应线性下降阶段的斜率（吸光度变化率/分钟）。
      • ΔA600_blank/min： 空白对照的斜率（吸光度变化率/分钟）。
      • V： 反应体系总体积 (mL)。
      • 1000： 单位转换系数（nmol）。
      • ε： DCPIP在600 nm处的摩尔消光系数（通常采用21.8 mM⁻¹ cm⁻¹ 或 2.18 × 10⁴ M⁻¹ cm⁻¹）。 （务必确认所用DCPIP在特定反应条件下的ε值，不同文献/批次可能略有差异）
      • d： 比色皿光径 (cm，通常为1 cm)。
      • C： 样品中蛋白质浓度 (mg/mL)。
    • 单位： 活性通常表示为每分钟每毫克蛋白还原DCPIP的纳摩尔数 (nmol/min/mg prot)。
 

四、 关键注意事项与优化策略

  1. 样品质量： 新鲜样品或妥善保存（-80°C速冻）的样品最佳。反复冻融会显著降低酶活性。匀浆过程需快速、低温、温和，避免过度剪切破坏线粒体结构。蛋白浓度过高可能导致非线性反应。
  2. 抑制剂有效性： 确保NaN₃/KCN、抗霉素A有效抑制下游复合体，防止电子通过其他途径传递导致背景升高。加入抑制剂后孵育足够时间（如5 min）。丙二酸抑制对照是验证反应特异性的关键。
  3. 反应线性： 确保监测的是反应初始线性阶段（通常前1-3分钟），此时底物浓度远高于酶浓度，反应速率恒定（零级反应）。反应时间过长会因底物消耗、产物抑制或酶失活导致非线性。
  4. DCPIP稳定性： DCPIP溶液需新鲜配制并避光保存。其还原反应对光敏感，操作和检测时应尽量避光。其消光系数需准确。
  5. 底物浓度： 使用饱和浓度的琥珀酸（通常20-50 mM）以确保酶被完全饱和。过低浓度会限制反应速率。
  6. pH与温度： 精确控制反应缓冲液的pH（通常7.4-7.8）和反应温度（25°C或30°C），因酶活性对此敏感。
  7. 浊度影响： 样品（尤其是组织匀浆）可能引入浊度，干扰吸光度读数。确保样品充分破碎并离心去除不溶物。空白对照可部分抵消浊度影响。
  8. 酶稀释度： 如果初始速率太快导致线性阶段太短，可稀释样品；反之速率太低则增加样本量或蛋白浓度。
  9. 替代方法： 铁氰化钾法（420 nm检测）在某些情况下更稳定、背景更低，且避免了DCPIP的光敏感性。但需注意铁氰化钾对某些酶有抑制作用。
 

五、 应用领域

复合体Ⅱ活性检测广泛应用于：

  • 基础研究： 探究能量代谢调控机制、线粒体功能、衰老生物学。
  • 疾病机制研究： 评估神经退行性疾病（帕金森病、阿尔茨海默病）、心血管疾病（心肌缺血再灌注损伤、心力衰竭）、代谢性疾病（糖尿病、肥胖）、癌症等中线粒体功能障碍的程度。
  • 药物/毒理学研究： 筛选靶向线粒体能量代谢的药物（如抗肿瘤药、神经保护剂），评估环境毒素或药物对线粒体的毒性作用。
  • 遗传学研究： 确定编码复合体Ⅱ亚基基因突变（如SDHA, SDHB, SDHC, SDHD）导致的致病机制（如副神经节瘤、嗜铬细胞瘤、Leigh综合征等）。
 

六、 总结

线粒体呼吸链复合体Ⅱ（琥珀酸脱氢酶）活性检测是评估线粒体功能的核心手段之一。基于分光光度法的DCPIP还原法是最常用的方法，原理清晰，操作相对简便。实验成功的关键在于确保样品活性完好、反应条件优化（底物饱和、抑制剂有效、pH/温度准确）、严格设置对照（特别是丙二酸抑制对照以验证特异性），并对数据进行正确的计算。铁氰化钾还原法是另一种可靠的选择。严格遵守实验细节和注意事项，能够获得可靠、可重复的复合体Ⅱ活性数据，为深入理解能量代谢及相关疾病的生理病理机制提供重要依据。

参考文献 (示例格式，请根据实际引用文献)

  1. Birch-Machin, M. A., & Turnbull, D. M. (2001). Assaying mitochondrial respiratory complex activity in mitochondria isolated from human cells and tissues. Methods in Cell Biology, 65, 97–117.
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  3. Janssen, A. J., Trijbels, F. J., Sengers, R. C., Smeitink, J. A., van den Heuvel, L. P., Wintjes, L. T., ... & Rodenburg, R. J. (2007). Spectrophotometric assay for complex I of the respiratory chain in tissue samples and cultured fibroblasts. Clinical Chemistry, 53(4), 729–734. (Protocols often include SDH/complex II).
  4. Kirby, D. M., Thorburn, D. R., Turnbull, D. M., & Taylor, R. W. (2007). Biochemical assays of respiratory chain complex activity. Methods in Cell Biology, 80, 93–119.
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