糖原磷酸化酶b(GPb)活性检测

发布时间:2025-06-27 16:39:33 阅读量:3 作者:生物检测中心

糖原磷酸化酶b (GPb) 活性检测方案

1. 引言
糖原磷酸化酶 (Glycogen Phosphorylase, GP, EC 2.4.1.1) 是糖原分解代谢的限速酶,催化糖原非还原端的α-1,4-糖苷键断裂,释放葡萄糖-1-磷酸 (Glucose-1-phosphate, G1P)。该酶存在两种主要形式:

  • 磷酸化酶a (GPa):磷酸化形式,具有高活性(不依赖别构效应物);
  • 磷酸化酶b (GPb):去磷酸化形式,其催化活性依赖于别构激活剂AMP的存在(主要在肌肉组织中)。
 

检测 糖原磷酸化酶b (GPb) 的活性对研究糖代谢调控、能量稳态及相关疾病机制至关重要。本方案详细描述了基于无机磷 (Pi) 释放的比色法测定GPb活性的原理及步骤。

2. 实验原理
在AMP存在的条件下,GPb催化以下反应:
(Glucose)ₙ + Pi ⇌ (Glucose)ₙ₋₁ + Glucose-1-Phosphate (G1P)

反应生成的G1P在反应体系中存在的 磷酸葡萄糖变位酶 (PGM, EC 5.4.2.2)葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 (G6PDH, EC 1.1.1.49) 作用下,被连续转化为葡萄糖-6-磷酸 (G6P),最终转化为6-磷酸葡萄糖酸 (6PG),同时将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (NADP⁺) 还原为 NADPH:

  1. G1P ⇌ G6P (PGM催化)
  2. G6P + NADP⁺ ⇌ 6PG + NADPH + H⁺ (G6PDH催化)
 

NADPH在340 nm波长处具有特征吸收峰。通过监测反应体系在340 nm处吸光度 (A₃₄₀) 随时间升高的速率 (ΔA₃₄₀/min),即可定量反映NADPH的生成速率,进而计算出GPb催化G1P生成的速率,即GPb的酶活性单位。

3. 材料与试剂

  • 缓冲液:
    • 50 mM 咪唑-HCl缓冲液 (pH 6.8,含1 mM EDTA):称取咪唑盐酸盐(或咪唑+适量HCl调节pH)溶于纯水,加入EDTA二钠盐,定容至所需体积,4℃保存。
  • 底物/辅助试剂:
    • 糖原 (Glycogen):2% (w/v) 糖原溶液 (溶于50 mM咪唑-HCl缓冲液, pH 6.8)。
    • 磷酸钾缓冲液 (Pi):1.0 M KH₂PO₄/K₂HPO₄缓冲液 (pH 6.8)。
    • 腺苷-5'-一磷酸 (AMP):50 mM AMP溶液 (溶于纯水或缓冲液),用于激活GPb。
    • 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (NADP⁺):10 mM NADP⁺溶液 (溶于纯水)。
  • 偶联酶试剂:
    • 磷酸葡萄糖变位酶 (PGM):适量活性单位(根据供应商建议的活力配制储备液)。
    • 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 (G6PDH):适量活性单位(根据供应商建议的活力配制储备液)。
    • 注意:配制好的偶联酶溶液应在冰上保存或按说明书要求保存。
  • 样品:
    • 待测酶液:含有GPb的组织提取物或纯化酶制剂。使用前用冰冷的50 mM咪唑-HCl缓冲液 (pH 6.8, 含1 mM EDTA) 适当稀释,置于冰上待用。需预先确定最佳稀释倍数。
  • 阴性对照:
    • 缓冲液:50 mM咪唑-HCl缓冲液 (pH 6.8, 含1 mM EDTA),代替酶液。
    • 无底物对照:反应体系中缺少糖原或Pi(根据情况选择)。
  • 仪器:
    • 紫外-可见分光光度计 (配有恒温比色皿架)
    • 恒温水浴锅
    • 移液器及无菌吸头
    • 石英或光学玻璃比色皿 (光径1 cm)
    • 计时器
    • 冰盒
 

4. 实验步骤 (以1 ml反应体系为例)

  1. 预热: 将水浴锅或分光光度计比色槽温度设定为30°C(或所需研究温度,如25°C或37°C)。
  2. 配制反应混合液(A): 在冰浴的微量离心管中混合以下成分:
    • 700 μL 50 mM 咪唑-HCl缓冲液 (pH 6.8, 1 mM EDTA)
    • 100 μL 2% (w/v) 糖原溶液
    • 100 μL 1.0 M 磷酸钾缓冲液 (Pi, pH 6.8)
    • 50 μL 50 mM AMP溶液
    • 20 μL 10 mM NADP⁺溶液
    • 适量 PGM 和 G6PDH (活力单位需足以保证偶联反应速度远快于GPb反应,通常按供应商推荐量加入)
      混匀,置于30°C水浴中预热5分钟。
  3. 加样启动反应: 取预热好的反应混合液(A) 980 μL 加入预热好的比色皿中。加入20 μL 预热好的(或保持低温的)待测酶稀释液(或阴性对照液)。立即轻柔颠倒混匀数次(避免产生气泡)。
  4. 监测反应: 迅速将比色皿放入已恒温(30°C)的分光光度计样品室中。立即开始计时,并记录反应起始时间点(t=0)在340 nm处的吸光度值 (A₀)。随后每隔30秒(或根据反应快慢设定更短或更长间隔,如15秒、1分钟)记录一次A₃₄₀值,持续监测5-10分钟(至少获取6-8个有效数据点)。确保反应初速度呈线性。
  5. 终止反应 (可选): 对于需要精确控制反应时间的实验,可在特定时间点(如5分钟)加入强酸(如0.5 mL 10% TCA)终止反应,然后离心去除沉淀,取上清液单独测定A₃₄₀(此步骤在连续监测法中一般省略)。
  6. 空白测定: 使用不含糖原(或Pi)的反应混合液,或不加酶液(用缓冲液代替)的反应体系作为空白对照,按照相同步骤操作并记录A₃₄₀变化。通常在正式实验前测定一次空白背景速率即可。
 

5. 数据处理与计算

  1. 计算反应速率 (ΔA₃₄₀/min): 选取反应初期线性变化阶段(通常前2-4分钟)的A₃₄₀数据点,以时间 (min) 为横坐标,A₃₄₀为纵坐标作图,进行线性回归,所得直线的斜率即为反应速率 (ΔA₃₄₀/min)。
  2. 扣除空白: 从待测样品的ΔA₃₄₀/min中减去空白对照的ΔA₃₄₀/min,得到 净反应速率 (v, ΔA₃₄₀/min)
  3. 计算酶活性单位 (U): 根据NADPH的摩尔消光系数 (ε₃₄₀ = 6.22 mM⁻¹ cm⁻¹,在pH >7.0时;在pH 6.8时略低,通常仍近似采用此值或在标准曲线中验证) 和反应体系总体积 (V_t, L),计算酶活性。
    • 摩尔消光系数法:
      酶活 (U/mL 或 U/mg) = [ v (ΔA/min) * V_t (mL) * DF ] / [ ε (mM⁻¹ cm⁻¹) * d (cm) * V_e (mL) ]
      • v:净反应速率 (ΔA/min)
      • V_t:反应体系总体积 (mL),此处为1 mL = 0.001 L
      • DF:样品稀释倍数 (若样品经稀释,例如原酶液稀释了10倍,则DF=10)
      • ε:NADPH在340 nm处的摩尔消光系数 (6.22 * 10³ L mol⁻¹ cm⁻¹ 或 6.22 mM⁻¹ cm⁻¹)
      • d:比色皿光径 (cm),通常为1 cm
      • V_e:加入反应体系中的酶液体积 (mL),此处为0.02 mL
    • 简化公式 (适用于1 cm光径比色皿,V_t=1mL, V_e=0.02mL):
      酶活 (U/mL) = [ v (ΔA/min) * 1000 (μmol/mol conversion) * DF ] / [ 6.22 * 0.02 ] ≈ [ v * DF * 8037. 8 ] / 1000 ≈ v * DF * 8.038
      (注:1000来源于将mmol/L转化为μmol/mL;精确计算请严格按摩尔消光系数法公式)
      酶活 (U/mg) = 酶活 (U/mL) / 酶蛋白浓度 (mg/mL)
  4. 酶活力单位定义: 在上述反应条件下(指定温度、pH、底物浓度),每分钟催化生成1 μmol NADPH(相当于1 μmol G1P)所需的酶量定义为1个酶活力单位 (Unit, U)。
 

6. 注意事项

  1. 样品制备: 组织样品需快速取材、液氮速冻,低温匀浆、离心提取酶液。提取缓冲液常含蛋白酶抑制剂、EDTA(螯合金属离子)、DTT(维持巯基还原态)、氟化钠(抑制磷酸酶)等保护酶活性。纯酶需确认储存条件和缓冲液成分。
  2. 稀释倍数: 酶液需预实验确定最佳稀释倍数,使测得的ΔA₃₄₀/min在0.02-0.2范围内(保证线性且信噪比好)。
  3. 温度控制: 严格控制反应温度(水浴预热充分,比色槽恒温),温度波动直接影响酶活。
  4. 反应线性: 确保监测的反应初速度阶段吸光度随时间呈良好线性 (R² > 0.98)。若线性不佳,可能因酶量过高(稀释不足)或过低(信号太弱)、偶联酶失效或底物耗尽。
  5. 偶联酶活力: PGM和G6PDH的活力必须足够高,确保其催化的两步反应速度远快于GPb反应,不成为限速步骤。需定期检查或更换偶联酶试剂。
  6. 试剂稳定性: NADP⁺、AMP溶液不稳定,应分装冻存,避免反复冻融。缓冲液、底物溶液也需新鲜配制或按要求保存。
  7. 空白对照: 必须设置合适的空白(无底物或无酶),扣除可能的背景反应(如酶液中杂酶、试剂自发反应)。
  8. pH值: 缓冲液pH必须精确校准至6.8,pH变化显著影响GPb对AMP的敏感性及催化效率。
  9. 特异性: 此方法检测的是GPb在AMP存在下的总活性。若要区分GPa和GPb,或研究变构调节,需设计包含不同效应物(如AMP、ATP、咖啡因、葡萄糖等)的对比实验。
  10. 安全: 实验操作需遵守实验室安全规范。涉及化学试剂需佩戴手套、护目镜。
 

7. 结论
本方案提供了一种灵敏、可靠、基于NADPH生成连续监测的比色法,用于测定糖原磷酸化酶b (GPb) 在AMP激活状态下的催化活性。通过严格控制实验条件(温度、pH、底物浓度、试剂质量)并仔细进行数据分析和扣除空白,可以获得准确的GPb活力数据,适用于基础研究、药物筛选及临床样本分析中对糖代谢关键酶活性的评估。


请注意:

  • 实际实验中涉及的 磷酸葡萄糖变位酶 (PGM)葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 (G6PDH) 均需外购获得,文中仅标明其作用而未提及任何特定品牌名称。
  • 所有试剂配制均描述为通用化学名称(如咪唑盐酸盐、EDTA二钠盐、KH₂PO₄/K₂HPO₄、AMP、NADP⁺、糖原),不涉及任何特定供应商。
  • 实验步骤和计算基于标准生物化学原理,未引用任何商品化试剂盒的操作流程。