糖原磷酸化酶b(GPb)活性检测

发布时间：2025-06-27 16:39:33 阅读量：2 作者：生物检测中心

糖原磷酸化酶b (GPb) 活性检测方案

1. 引言
糖原磷酸化酶 (Glycogen Phosphorylase, GP, EC 2.4.1.1) 是糖原分解代谢的限速酶，催化糖原非还原端的α-1,4-糖苷键断裂，释放葡萄糖-1-磷酸 (Glucose-1-phosphate, G1P)。该酶存在两种主要形式：

  • 磷酸化酶a (GPa)：磷酸化形式，具有高活性（不依赖别构效应物）；
  • 磷酸化酶b (GPb)：去磷酸化形式，其催化活性依赖于别构激活剂AMP的存在（主要在肌肉组织中）。
 

检测 糖原磷酸化酶b (GPb) 的活性对研究糖代谢调控、能量稳态及相关疾病机制至关重要。本方案详细描述了基于无机磷 (Pi) 释放的比色法测定GPb活性的原理及步骤。

2. 实验原理
在AMP存在的条件下，GPb催化以下反应：
(Glucose)ₙ + Pi ⇌ (Glucose)ₙ₋₁ + Glucose-1-Phosphate (G1P)

反应生成的G1P在反应体系中存在的 磷酸葡萄糖变位酶 (PGM, EC 5.4.2.2) 和 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 (G6PDH, EC 1.1.1.49) 作用下，被连续转化为葡萄糖-6-磷酸 (G6P)，最终转化为6-磷酸葡萄糖酸 (6PG)，同时将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (NADP⁺) 还原为 NADPH：

  1. G1P ⇌ G6P (PGM催化)
  2. G6P + NADP⁺ ⇌ 6PG + NADPH + H⁺ (G6PDH催化)
 

NADPH在340 nm波长处具有特征吸收峰。通过监测反应体系在340 nm处吸光度 (A₃₄₀) 随时间升高的速率 (ΔA₃₄₀/min)，即可定量反映NADPH的生成速率，进而计算出GPb催化G1P生成的速率，即GPb的酶活性单位。

3. 材料与试剂

  • 缓冲液：
    • 50 mM 咪唑-HCl缓冲液 (pH 6.8，含1 mM EDTA)：称取咪唑盐酸盐（或咪唑+适量HCl调节pH）溶于纯水，加入EDTA二钠盐，定容至所需体积，4℃保存。
  • 底物/辅助试剂：
    • 糖原 (Glycogen)：2% (w/v) 糖原溶液 (溶于50 mM咪唑-HCl缓冲液, pH 6.8)。
    • 磷酸钾缓冲液 (Pi)：1.0 M KH₂PO₄/K₂HPO₄缓冲液 (pH 6.8)。
    • 腺苷-5'-一磷酸 (AMP)：50 mM AMP溶液 (溶于纯水或缓冲液)，用于激活GPb。
    • 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (NADP⁺)：10 mM NADP⁺溶液 (溶于纯水)。
  • 偶联酶试剂：
    • 磷酸葡萄糖变位酶 (PGM)：适量活性单位（根据供应商建议的活力配制储备液）。
    • 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 (G6PDH)：适量活性单位（根据供应商建议的活力配制储备液）。
    • 注意：配制好的偶联酶溶液应在冰上保存或按说明书要求保存。
  • 样品：
    • 待测酶液：含有GPb的组织提取物或纯化酶制剂。使用前用冰冷的50 mM咪唑-HCl缓冲液 (pH 6.8, 含1 mM EDTA) 适当稀释，置于冰上待用。需预先确定最佳稀释倍数。
  • 阴性对照：
    • 缓冲液：50 mM咪唑-HCl缓冲液 (pH 6.8, 含1 mM EDTA)，代替酶液。
    • 无底物对照：反应体系中缺少糖原或Pi（根据情况选择）。
  • 仪器：
    • 紫外-可见分光光度计 (配有恒温比色皿架)
    • 恒温水浴锅
    • 移液器及无菌吸头
    • 石英或光学玻璃比色皿 (光径1 cm)
    • 计时器
    • 冰盒
 

4. 实验步骤 (以1 ml反应体系为例)

  1. 预热： 将水浴锅或分光光度计比色槽温度设定为30°C（或所需研究温度，如25°C或37°C）。
  2. 配制反应混合液(A)： 在冰浴的微量离心管中混合以下成分：
    • 700 μL 50 mM 咪唑-HCl缓冲液 (pH 6.8, 1 mM EDTA)
    • 100 μL 2% (w/v) 糖原溶液
    • 100 μL 1.0 M 磷酸钾缓冲液 (Pi, pH 6.8)
    • 50 μL 50 mM AMP溶液
    • 20 μL 10 mM NADP⁺溶液
    • 适量 PGM 和 G6PDH （活力单位需足以保证偶联反应速度远快于GPb反应，通常按供应商推荐量加入）
      混匀，置于30°C水浴中预热5分钟。
  3. 加样启动反应： 取预热好的反应混合液(A) 980 μL 加入预热好的比色皿中。加入20 μL 预热好的（或保持低温的）待测酶稀释液（或阴性对照液）。立即轻柔颠倒混匀数次（避免产生气泡）。
  4. 监测反应： 迅速将比色皿放入已恒温（30°C）的分光光度计样品室中。立即开始计时，并记录反应起始时间点（t=0）在340 nm处的吸光度值 (A₀)。随后每隔30秒（或根据反应快慢设定更短或更长间隔，如15秒、1分钟）记录一次A₃₄₀值，持续监测5-10分钟（至少获取6-8个有效数据点）。确保反应初速度呈线性。
  5. 终止反应 (可选)： 对于需要精确控制反应时间的实验，可在特定时间点（如5分钟）加入强酸（如0.5 mL 10% TCA）终止反应，然后离心去除沉淀，取上清液单独测定A₃₄₀（此步骤在连续监测法中一般省略）。
  6. 空白测定： 使用不含糖原（或Pi）的反应混合液，或不加酶液（用缓冲液代替）的反应体系作为空白对照，按照相同步骤操作并记录A₃₄₀变化。通常在正式实验前测定一次空白背景速率即可。
 

5. 数据处理与计算

  1. 计算反应速率 (ΔA₃₄₀/min)： 选取反应初期线性变化阶段（通常前2-4分钟）的A₃₄₀数据点，以时间 (min) 为横坐标，A₃₄₀为纵坐标作图，进行线性回归，所得直线的斜率即为反应速率 (ΔA₃₄₀/min)。
  2. 扣除空白： 从待测样品的ΔA₃₄₀/min中减去空白对照的ΔA₃₄₀/min，得到 净反应速率 (v, ΔA₃₄₀/min)。
  3. 计算酶活性单位 (U)： 根据NADPH的摩尔消光系数 (ε₃₄₀ = 6.22 mM⁻¹ cm⁻¹，在pH >7.0时；在pH 6.8时略低，通常仍近似采用此值或在标准曲线中验证) 和反应体系总体积 (V_t, L)，计算酶活性。
    • 摩尔消光系数法：
      酶活 (U/mL 或 U/mg) = [ v (ΔA/min) * V_t (mL) * DF ] / [ ε (mM⁻¹ cm⁻¹) * d (cm) * V_e (mL) ]
      • v：净反应速率 (ΔA/min)
      • V_t：反应体系总体积 (mL)，此处为1 mL = 0.001 L
      • DF：样品稀释倍数 (若样品经稀释，例如原酶液稀释了10倍，则DF=10)
      • ε：NADPH在340 nm处的摩尔消光系数 (6.22 * 10³ L mol⁻¹ cm⁻¹ 或 6.22 mM⁻¹ cm⁻¹)
      • d：比色皿光径 (cm)，通常为1 cm
      • V_e：加入反应体系中的酶液体积 (mL)，此处为0.02 mL
    • 简化公式 (适用于1 cm光径比色皿，V_t=1mL, V_e=0.02mL)：
      酶活 (U/mL) = [ v (ΔA/min) * 1000 (μmol/mol conversion) * DF ] / [ 6.22 * 0.02 ] ≈ [ v * DF * 8037. 8 ] / 1000 ≈ v * DF * 8.038
      (注：1000来源于将mmol/L转化为μmol/mL；精确计算请严格按摩尔消光系数法公式)
      酶活 (U/mg) = 酶活 (U/mL) / 酶蛋白浓度 (mg/mL)
  4. 酶活力单位定义： 在上述反应条件下（指定温度、pH、底物浓度），每分钟催化生成1 μmol NADPH（相当于1 μmol G1P）所需的酶量定义为1个酶活力单位 (Unit, U)。
 

6. 注意事项

  1. 样品制备： 组织样品需快速取材、液氮速冻，低温匀浆、离心提取酶液。提取缓冲液常含蛋白酶抑制剂、EDTA（螯合金属离子）、DTT（维持巯基还原态）、氟化钠（抑制磷酸酶）等保护酶活性。纯酶需确认储存条件和缓冲液成分。
  2. 稀释倍数： 酶液需预实验确定最佳稀释倍数，使测得的ΔA₃₄₀/min在0.02-0.2范围内（保证线性且信噪比好）。
  3. 温度控制： 严格控制反应温度（水浴预热充分，比色槽恒温），温度波动直接影响酶活。
  4. 反应线性： 确保监测的反应初速度阶段吸光度随时间呈良好线性 (R² > 0.98)。若线性不佳，可能因酶量过高（稀释不足）或过低（信号太弱）、偶联酶失效或底物耗尽。
  5. 偶联酶活力： PGM和G6PDH的活力必须足够高，确保其催化的两步反应速度远快于GPb反应，不成为限速步骤。需定期检查或更换偶联酶试剂。
  6. 试剂稳定性： NADP⁺、AMP溶液不稳定，应分装冻存，避免反复冻融。缓冲液、底物溶液也需新鲜配制或按要求保存。
  7. 空白对照： 必须设置合适的空白（无底物或无酶），扣除可能的背景反应（如酶液中杂酶、试剂自发反应）。
  8. pH值： 缓冲液pH必须精确校准至6.8，pH变化显著影响GPb对AMP的敏感性及催化效率。
  9. 特异性： 此方法检测的是GPb在AMP存在下的总活性。若要区分GPa和GPb，或研究变构调节，需设计包含不同效应物（如AMP、ATP、咖啡因、葡萄糖等）的对比实验。
  10. 安全： 实验操作需遵守实验室安全规范。涉及化学试剂需佩戴手套、护目镜。
 

7. 结论
本方案提供了一种灵敏、可靠、基于NADPH生成连续监测的比色法，用于测定糖原磷酸化酶b (GPb) 在AMP激活状态下的催化活性。通过严格控制实验条件（温度、pH、底物浓度、试剂质量）并仔细进行数据分析和扣除空白，可以获得准确的GPb活力数据，适用于基础研究、药物筛选及临床样本分析中对糖代谢关键酶活性的评估。

请注意：

  • 实际实验中涉及的 磷酸葡萄糖变位酶 (PGM) 和 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 (G6PDH) 均需外购获得，文中仅标明其作用而未提及任何特定品牌名称。
  • 所有试剂配制均描述为通用化学名称（如咪唑盐酸盐、EDTA二钠盐、KH₂PO₄/K₂HPO₄、AMP、NADP⁺、糖原），不涉及任何特定供应商。
  • 实验步骤和计算基于标准生物化学原理，未引用任何商品化试剂盒的操作流程。