糖原磷酸化酶a (GPa) 活性检测方法
1. 引言
糖原磷酸化酶 (Glycogen Phosphorylase, GP) 是糖原分解代谢的关键限速酶,催化糖原非还原端葡萄糖残基的磷酸解反应,释放1-磷酸葡萄糖 (Glucose-1-P)。该酶存在两种可相互转化的形式:
- 糖原磷酸化酶a (GPa):磷酸化的活化形式,在缺乏变构激活剂AMP时即具有显著活性。
- 糖原磷酸化酶b (GPb):去磷酸化的形式,其活性高度依赖于变构激活剂AMP的存在。
检测 GPa活性 对于研究糖原代谢调控(如激素作用、能量状态变化)、酶动力学、酶磷酸化状态以及相关疾病机制(如糖原贮积症)至关重要。本方法描述了体外测定GPa活性的基本原理和详细操作步骤。
2. 检测原理
本方法基于GPa催化糖原磷酸解产生无机磷酸根 (Pi) 的反应进行测定:
(糖原)_n + Pi ⇌ (糖原)_n-1 + Glucose-1-P
- 反应优化: 在特定缓冲体系中,严格控制pH(通常为6.8左右)和温度(通常为30°C或37°C),并提供过量的糖原底物。反应体系中加入激活剂 AMP,它不仅能最大程度激活GPa本身,更重要的是能有效抑制样品中可能存在的GPb活性,从而确保检测结果特异性地反映GPa的活性。
- Pi定量: 反应终止后,检测反应过程中释放的无机磷酸根 (Pi) 的量作为酶活性的指标。
- 显色方法: 采用经典的磷钼酸盐比色法(Fiske-Subbarow改良法)定量Pi。在酸性条件下,Pi与钼酸铵反应生成磷钼酸复合物,该复合物可被还原剂(如1-氨基-2-萘酚-4-磺酸, ANSA)还原生成蓝色的钼蓝复合物。蓝色的深浅与Pi浓度成正比,可在特定波长(通常为660 nm或700 nm)测定吸光度值(OD值)。
3. 试剂与溶液
- 反应缓冲液 (0.1 M, pH 6.8):
- 含0.1 M 柠檬酸钠或Na-HEPES缓冲液 (pH 6.8)。
- 含0.1 M NaF (抑制磷酸酶)。
- 含0.5 mM EDTA (螯合金属离子)。
- 含0.5% (w/v) 牛血清白蛋白 (BSA) 或明胶 (稳定酶蛋白)。
- 临用前加入 50 mM AMP (激活GPa并抑制GPb)。
- 糖原溶液 (2%, w/v): 兔肝或牡蛎糖原溶解于反应缓冲液(不含AMP)中。煮沸助溶,冷却备用。
- 终止液 / 显色剂 (混合液): 将以下溶液按比例混合(现配现用):
- 一份:10% (w/v) SDS 溶液(终止反应并溶解蛋白干扰)。
- 一份:2.5% (w/v) 钼酸铵 (溶于 5N H2SO4)。
- 一份:还原剂溶液 (如:0.25% (w/v) 1-氨基-2-萘酚-4-磺酸 (ANSA) 溶于15% (w/v) 亚硫酸氢钠和1.5% (w/v) 焦亚硫酸钠溶液中。过滤后使用。也可使用其他还原剂如抗坏血酸)。
- 无机磷 (Pi) 标准溶液 (10 mM): 精确称取无水KH2PO4溶于双蒸水。
- 待测酶样品: 组织匀浆上清液、细胞裂解液或部分纯化的酶制剂。样品需在冰上制备,保持低温(0-4°C),通常用含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂(如NaF + Na3VO4 + β-甘油磷酸)的缓冲液稀释。蛋白浓度需测定(如Bradford法),以便后续计算比活力。
4. 实验步骤
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标准曲线制备:
- 用反应缓冲液(含AMP)将10 mM Pi标准溶液稀释成一系列浓度(如 0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 mM)。
- 取50 μL各浓度标准Pi溶液,分别加入小离心管或酶标板孔中。
- 各管/孔中加入50 μL终止液/显色剂混合液,立即涡旋混匀。
- 室温避光放置20-40分钟,使蓝色显色完全。
- 在660 nm或700 nm波长下测定各管OD值。
- 以OD值为纵坐标,Pi浓度(nmol/管或 μmol/mL)为横坐标,绘制标准曲线(通常为线性)。
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GPa活性测定:
- 预温育: 将反应缓冲液(含AMP)和糖原溶液在设定的反应温度(如30°C)的水浴或孵育器中预温至少5分钟。
- 启动反应:
- 取小离心管或酶标板孔,依次加入:
- 50 μL 预温的反应缓冲液(含AMP)。
- 50 μL 预温的2%糖原溶液。
- 轻轻混匀。
- 加入适量体积的预冷待测酶样品(如20-50 μL,根据预实验确定线性范围),立即涡旋混匀(或吹打混匀)。此步定义为反应起始时间(t=0)。
- 注意:需设定 样品空白对照:将酶样品替换为等体积的样品稀释缓冲液(含相同浓度抑制剂/稳定剂)。
- 取小离心管或酶标板孔,依次加入:
- 孵育反应: 将反应管/板置于设定温度(如30°C)精确孵育预定时间(如5-20分钟,需在线性范围内)。
- 终止反应与显色:
- 孵育结束时,立即加入100 μL预冷的终止液/显色剂混合液,迅速涡旋混匀(或吹打混匀),终止酶反应。
- 显色与测定: 室温避光放置20-40分钟,确保蓝色完全生成稳定。在660 nm或700 nm波长下测定各管OD值。
- 计算:
- 根据测得的OD值,从标准曲线上查出各反应管(包括样品管和样品空白管)对应的Pi生成量(nmol)。
- 样品管Pi生成量 (净值) = 样品管Pi生成量 - 样品空白管Pi生成量。
- 酶活性计算:
- 总活性 (Units) = (Pi净生成量 (nmol) / 反应时间 (min) )
- 比活性 (Specific Activity) = 总活性 (Units) / 反应体系中的蛋白量 (mg)
- 单位定义 (U): 在上述特定反应条件下,每分钟催化产生1 μmol(或1 nmol)无机磷酸根 (Pi) 所需的酶量定义为1 个单位。最常用的是每分钟产生1 μmol Pi。
5. 关键参数与质量控制
- 线性范围验证: 必须确保选定的孵育时间和酶样品量在Pi生成量与时间/酶量呈线性关系的范围内(通常Pi生成量在0.1 - 0.5 μmol之间线性较好)。需通过预实验确定。
- 温度控制: 水浴或孵育器的温度需精确恒定。
- 时间控制: 反应起始(加酶)和终止(加终止液)需精确计时。
- 样品处理: 酶样品制备和稀释全程需在冰上进行,避免反复冻融。
- 特异性: AMP的存在是确保检测特异针对GPa的关键。
- 背景扣除: 必须设置样品空白对照(无酶)以扣除非酶促产生的Pi本底。
- 标准曲线: 每次实验必须新鲜配制Pi标准溶液并绘制标准曲线。
- 重复性: 每个样品应至少做2-3个平行管/孔。
6. 注意事项
- 试剂纯度: 使用高纯度的糖原和试剂。
- 水质: 使用去离子水或双蒸水配制所有溶液。
- 显色稳定性: 钼蓝复合物在一定时间内稳定,但应尽快完成读数(通常在显色后1小时内)。避免强光直射。
- 干扰物: 样品中高浓度的还原性物质或磷酸盐可能干扰显色或本底。可通过稀释样品或设置严格的对照来减少干扰。
- 酶稳定性: GPa在稀释或处理过程中可能不稳定。样品应尽快检测。
- pH: 反应缓冲液的pH需精确配制和校准。
- 样品浓度: 酶样品蛋白浓度不宜过高,以免引入过多杂质干扰反应或显色。
- 安全: 硫酸、钼酸铵等为腐蚀性或刺激性化学品,操作时需穿戴防护装备。
7. 总结
本方法提供了一种稳定、可靠且特异性强的体外定量检测糖原磷酸化酶a (GPa) 活性的方案。其核心在于利用AMP选择性激活GPa并抑制GPb,并通过测定磷酸解反应释放的无机磷量来反映酶活性。严格控制反应条件(pH、温度、时间)和设立严谨的对照是本方法获得准确结果的关键。该方法适用于多种生物样本(组织、细胞)中GPa活性的研究。