糖原磷酸化酶a(GPa) 活性检测 - 中析研究所生物检测中心

糖原磷酸化酶a (GPa) 活性检测方法

1. 引言
糖原磷酸化酶 (Glycogen Phosphorylase, GP) 是糖原分解代谢的关键限速酶，催化糖原非还原端葡萄糖残基的磷酸解反应，释放1-磷酸葡萄糖 (Glucose-1-P)。该酶存在两种可相互转化的形式：

糖原磷酸化酶a (GPa)：磷酸化的活化形式，在缺乏变构激活剂AMP时即具有显著活性。
糖原磷酸化酶b (GPb)：去磷酸化的形式，其活性高度依赖于变构激活剂AMP的存在。

检测 GPa活性 对于研究糖原代谢调控（如激素作用、能量状态变化）、酶动力学、酶磷酸化状态以及相关疾病机制（如糖原贮积症）至关重要。本方法描述了体外测定GPa活性的基本原理和详细操作步骤。

2. 检测原理
本方法基于GPa催化糖原磷酸解产生无机磷酸根 (Pi) 的反应进行测定：

(糖原)_n + Pi ⇌ (糖原)_n-1 + Glucose-1-P

反应优化： 在特定缓冲体系中，严格控制pH（通常为6.8左右）和温度（通常为30°C或37°C），并提供过量的糖原底物。反应体系中加入激活剂 AMP，它不仅能最大程度激活GPa本身，更重要的是能有效抑制样品中可能存在的GPb活性，从而确保检测结果特异性地反映GPa的活性。
Pi定量： 反应终止后，检测反应过程中释放的无机磷酸根 (Pi) 的量作为酶活性的指标。
显色方法： 采用经典的磷钼酸盐比色法（Fiske-Subbarow改良法）定量Pi。在酸性条件下，Pi与钼酸铵反应生成磷钼酸复合物，该复合物可被还原剂（如1-氨基-2-萘酚-4-磺酸, ANSA）还原生成蓝色的钼蓝复合物。蓝色的深浅与Pi浓度成正比，可在特定波长（通常为660 nm或700 nm）测定吸光度值（OD值）。

3. 试剂与溶液

反应缓冲液 (0.1 M, pH 6.8):
- 含0.1 M 柠檬酸钠或Na-HEPES缓冲液 (pH 6.8)。
- 含0.1 M NaF (抑制磷酸酶)。
- 含0.5 mM EDTA (螯合金属离子)。
- 含0.5% (w/v) 牛血清白蛋白 (BSA) 或明胶 (稳定酶蛋白)。
- 临用前加入 50 mM AMP (激活GPa并抑制GPb)。
糖原溶液 (2%, w/v): 兔肝或牡蛎糖原溶解于反应缓冲液（不含AMP）中。煮沸助溶，冷却备用。
终止液 / 显色剂 (混合液): 将以下溶液按比例混合（现配现用）：
- 一份：10% (w/v) SDS 溶液（终止反应并溶解蛋白干扰）。
- 一份：2.5% (w/v) 钼酸铵 (溶于 5N H2SO4)。
- 一份：还原剂溶液 (如：0.25% (w/v) 1-氨基-2-萘酚-4-磺酸 (ANSA) 溶于15% (w/v) 亚硫酸氢钠和1.5% (w/v) 焦亚硫酸钠溶液中。过滤后使用。也可使用其他还原剂如抗坏血酸)。
无机磷 (Pi) 标准溶液 (10 mM): 精确称取无水KH2PO4溶于双蒸水。
待测酶样品: 组织匀浆上清液、细胞裂解液或部分纯化的酶制剂。样品需在冰上制备，保持低温（0-4°C），通常用含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂（如NaF + Na3VO4 + β-甘油磷酸）的缓冲液稀释。蛋白浓度需测定（如Bradford法），以便后续计算比活力。

4. 实验步骤

标准曲线制备：
1. 用反应缓冲液（含AMP）将10 mM Pi标准溶液稀释成一系列浓度（如 0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 mM）。
2. 取50 μL各浓度标准Pi溶液，分别加入小离心管或酶标板孔中。
3. 各管/孔中加入50 μL终止液/显色剂混合液，立即涡旋混匀。
4. 室温避光放置20-40分钟，使蓝色显色完全。
5. 在660 nm或700 nm波长下测定各管OD值。
6. 以OD值为纵坐标，Pi浓度（nmol/管或 μmol/mL）为横坐标，绘制标准曲线（通常为线性）。
GPa活性测定：
1. 预温育： 将反应缓冲液（含AMP）和糖原溶液在设定的反应温度（如30°C）的水浴或孵育器中预温至少5分钟。
2. 启动反应：
  - 取小离心管或酶标板孔，依次加入：
    - 50 μL 预温的反应缓冲液（含AMP）。
    - 50 μL 预温的2%糖原溶液。
    - 轻轻混匀。
  - 加入适量体积的预冷待测酶样品（如20-50 μL，根据预实验确定线性范围），立即涡旋混匀（或吹打混匀）。此步定义为反应起始时间（t=0）。
  - 注意：需设定 样品空白对照：将酶样品替换为等体积的样品稀释缓冲液（含相同浓度抑制剂/稳定剂）。
3. 孵育反应： 将反应管/板置于设定温度（如30°C）精确孵育预定时间（如5-20分钟，需在线性范围内）。
4. 终止反应与显色：
  - 孵育结束时，立即加入100 μL预冷的终止液/显色剂混合液，迅速涡旋混匀（或吹打混匀），终止酶反应。
5. 显色与测定： 室温避光放置20-40分钟，确保蓝色完全生成稳定。在660 nm或700 nm波长下测定各管OD值。
6. 计算：
  - 根据测得的OD值，从标准曲线上查出各反应管（包括样品管和样品空白管）对应的Pi生成量（nmol）。
  - 样品管Pi生成量 (净值) = 样品管Pi生成量 - 样品空白管Pi生成量。
  - 酶活性计算：
    - 总活性 (Units) = (Pi净生成量 (nmol) / 反应时间 (min) )
    - 比活性 (Specific Activity) = 总活性 (Units) / 反应体系中的蛋白量 (mg)
    - 单位定义 (U): 在上述特定反应条件下，每分钟催化产生1 μmol（或1 nmol）无机磷酸根 (Pi) 所需的酶量定义为1 个单位。最常用的是每分钟产生1 μmol Pi。

5. 关键参数与质量控制

线性范围验证： 必须确保选定的孵育时间和酶样品量在Pi生成量与时间/酶量呈线性关系的范围内（通常Pi生成量在0.1 - 0.5 μmol之间线性较好）。需通过预实验确定。
温度控制： 水浴或孵育器的温度需精确恒定。
时间控制： 反应起始（加酶）和终止（加终止液）需精确计时。
样品处理： 酶样品制备和稀释全程需在冰上进行，避免反复冻融。
特异性： AMP的存在是确保检测特异针对GPa的关键。
背景扣除： 必须设置样品空白对照（无酶）以扣除非酶促产生的Pi本底。
标准曲线： 每次实验必须新鲜配制Pi标准溶液并绘制标准曲线。
重复性： 每个样品应至少做2-3个平行管/孔。

6. 注意事项

试剂纯度： 使用高纯度的糖原和试剂。
水质： 使用去离子水或双蒸水配制所有溶液。
显色稳定性： 钼蓝复合物在一定时间内稳定，但应尽快完成读数（通常在显色后1小时内）。避免强光直射。
干扰物： 样品中高浓度的还原性物质或磷酸盐可能干扰显色或本底。可通过稀释样品或设置严格的对照来减少干扰。
酶稳定性： GPa在稀释或处理过程中可能不稳定。样品应尽快检测。
pH： 反应缓冲液的pH需精确配制和校准。
样品浓度： 酶样品蛋白浓度不宜过高，以免引入过多杂质干扰反应或显色。
安全： 硫酸、钼酸铵等为腐蚀性或刺激性化学品，操作时需穿戴防护装备。

7. 总结
本方法提供了一种稳定、可靠且特异性强的体外定量检测糖原磷酸化酶a (GPa) 活性的方案。其核心在于利用AMP选择性激活GPa并抑制GPb，并通过测定磷酸解反应释放的无机磷量来反映酶活性。严格控制反应条件（pH、温度、时间）和设立严谨的对照是本方法获得准确结果的关键。该方法适用于多种生物样本（组织、细胞）中GPa活性的研究。