糖原合成酶活性检测技术详解
糖原合成酶是糖原合成的关键限速酶,其活性测定对于理解糖代谢调控、研究糖尿病、糖原贮积症等疾病机制至关重要。以下为完整实验方案:
一、检测原理
基于放射性或比色法标记的尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-[14C]glucose 或 UDPG)作为糖基供体:
- 酶促反应:GS催化UDPG的葡萄糖基转移至糖原引物
GS + UDPG + 糖原引物 → UDP + 延长糖原链
- 终止反应:强碱终止并水解未掺入的UDPG
- 产物捕获:
- 放射性法:通过滤膜捕获[14C]标记糖原,液闪计数
- 比色法:检测反应生成的UDP(如丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶偶联法)
二、实验材料
- 组织样本:肝/肌肉组织、培养细胞
- 关键试剂:
- 提取缓冲液:50 mM Tris-HCl (pH 7.8), 10 mM EDTA, 100 mM KF, 1 mM DTT
- 反应缓冲液:50 mM Tris-HCl (pH 7.8), 20 mM EDTA, 25 mM KF, 1% 糖原
- UDPG (含[14C]标记或未标记)
- 葡萄糖-6-磷酸(G6P)
- 反应终止液:30% KOH
- 仪器:
- 匀浆器、离心机、恒温水浴槽
- 液闪计数器(放射性法)或分光光度计(比色法)
- 玻璃纤维滤膜(Whatman GF/C 类)
三、操作流程
1. 酶粗提液制备
MarkDown
1. 取100 mg组织加入1 mL预冷提取缓冲液 2. 冰上匀浆(15秒 × 3次,间隔30秒) 3. 12,000×g, 4℃离心20分钟 4. 取上清液为酶提取液(立即使用或-80℃保存)
2. 反应体系构建(100 μL体系)
组分 | 体积 | 终浓度 |
---|---|---|
反应缓冲液 | 50 μL | 1× |
酶提取液 | 20 μL | 适量蛋白 |
10 mM UDPG | 10 μL | 1 mM |
[14C]UDPG (0.1 μCi/μL) | 5 μL(放射性法) | - |
0 or 10 mM G6P | 15 μL | 0或1.5 mM |
关键对照:
- 总活性:含10 mM G6P(完全激活GS)
- Ⅰ型活性(活性形式):不含G6P
- 空白对照:灭活酶液或缓冲液替代酶液
3. 反应进程控制
- 37℃孵育 10–30分钟(需预实验确定线性反应时间)
- 加入100 μL 30% KOH终止反应
4. 产物检测
- 放射性法:
- 取100 μL反应液滴至玻璃纤维滤膜
- 3×3 mL 66%乙醇洗涤(去除非掺入UDPG)
- 烘干滤膜,液闪计数放射性
- 比色法:
- 按试剂盒方法检测生成UDP量(需匹配标准曲线)
四、数据处理
- 酶活性计算:
活性 (nmol/min/mg prot) = (样品CPM - 空白CPM) × UDPG浓度 / (比放射性 × 时间 × 蛋白量)
- 活化系数(反映磷酸化状态):
活化系数 = I型活性(-G6P) / 总活性(+G6P)
五、关键注意事项
- 糖原引物:必须添加外源糖原(1%)作为葡萄糖基受体
- KF作用:抑制糖原磷酸化酶活性(常用终浓度25 mM)
- G6P浓度优化:一般使用0-10 mM梯度确定最佳激活浓度
- 反应线性验证:需确认产物生成量与时间/酶量呈正比
- 样本新鲜度:磷酸酶易降解,建议快速处理样本
六、应用与意义
- 代谢疾病研究:II型糖尿病中GS活性显著降低
- 胰岛素信号通路:检测Akt/GSK3通路对GS的调控
- 药物开发:筛选GS激活剂(如用于糖尿病治疗)
- 遗传性疾病诊断:糖原合成酶缺乏症(GSD 0型)
本方案适用于科研用途,实际操作需根据实验室条件优化参数。结果解读需结合磷酸化蛋白印迹(如GS Ser641位点磷酸化检测)进行综合分析。
通过精确控制G6P浓度区分酶的活化与非活化形式,此方法为研究糖原代谢的动态调控提供了可靠的技术支持。