糖原合成酶(GS)活性检测

发布时间:2025-06-27 16:36:04 阅读量:3 作者:生物检测中心

糖原合成酶活性检测技术详解

糖原合成酶是糖原合成的关键限速酶,其活性测定对于理解糖代谢调控、研究糖尿病、糖原贮积症等疾病机制至关重要。以下为完整实验方案:


一、检测原理

基于放射性或比色法标记的尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-[14C]glucose 或 UDPG)作为糖基供体:

  1. 酶促反应:GS催化UDPG的葡萄糖基转移至糖原引物
    GS + UDPG + 糖原引物 → UDP + 延长糖原链
  2. 终止反应:强碱终止并水解未掺入的UDPG
  3. 产物捕获
    • 放射性法:通过滤膜捕获[14C]标记糖原,液闪计数
    • 比色法:检测反应生成的UDP(如丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶偶联法)
 

二、实验材料

  • 组织样本:肝/肌肉组织、培养细胞
  • 关键试剂
    • 提取缓冲液:50 mM Tris-HCl (pH 7.8), 10 mM EDTA, 100 mM KF, 1 mM DTT
    • 反应缓冲液:50 mM Tris-HCl (pH 7.8), 20 mM EDTA, 25 mM KF, 1% 糖原
    • UDPG (含[14C]标记或未标记)
    • 葡萄糖-6-磷酸(G6P)
    • 反应终止液:30% KOH
  • 仪器
    • 匀浆器、离心机、恒温水浴槽
    • 液闪计数器(放射性法)或分光光度计(比色法)
    • 玻璃纤维滤膜(Whatman GF/C 类)
 

三、操作流程

1. 酶粗提液制备

 
MarkDown
 
1. 取100 mg组织加入1 mL预冷提取缓冲液 2. 冰上匀浆(15秒 × 3次,间隔30秒) 3. 12,000×g, 4℃离心20分钟 4. 取上清液为酶提取液(立即使用或-80℃保存)

2. 反应体系构建(100 μL体系)

组分 体积 终浓度
反应缓冲液 50 μL
酶提取液 20 μL 适量蛋白
10 mM UDPG 10 μL 1 mM
[14C]UDPG (0.1 μCi/μL) 5 μL(放射性法) -
0 or 10 mM G6P 15 μL 0或1.5 mM

关键对照

  • 总活性:含10 mM G6P(完全激活GS)
  • Ⅰ型活性(活性形式):不含G6P
  • 空白对照:灭活酶液或缓冲液替代酶液

3. 反应进程控制

  • 37℃孵育 10–30分钟(需预实验确定线性反应时间)
  • 加入100 μL 30% KOH终止反应
 

4. 产物检测

  • 放射性法
    1. 取100 μL反应液滴至玻璃纤维滤膜
    2. 3×3 mL 66%乙醇洗涤(去除非掺入UDPG)
    3. 烘干滤膜,液闪计数放射性
  • 比色法
    1. 按试剂盒方法检测生成UDP量(需匹配标准曲线)
 

四、数据处理

  • 酶活性计算
    活性 (nmol/min/mg prot) = (样品CPM - 空白CPM) × UDPG浓度 / (比放射性 × 时间 × 蛋白量)
  • 活化系数(反映磷酸化状态):
    活化系数 = I型活性(-G6P) / 总活性(+G6P)
 

五、关键注意事项

  1. 糖原引物:必须添加外源糖原(1%)作为葡萄糖基受体
  2. KF作用:抑制糖原磷酸化酶活性(常用终浓度25 mM)
  3. G6P浓度优化:一般使用0-10 mM梯度确定最佳激活浓度
  4. 反应线性验证:需确认产物生成量与时间/酶量呈正比
  5. 样本新鲜度:磷酸酶易降解,建议快速处理样本
 

六、应用与意义

  • 代谢疾病研究:II型糖尿病中GS活性显著降低
  • 胰岛素信号通路:检测Akt/GSK3通路对GS的调控
  • 药物开发:筛选GS激活剂(如用于糖尿病治疗)
  • 遗传性疾病诊断:糖原合成酶缺乏症(GSD 0型)
 

本方案适用于科研用途,实际操作需根据实验室条件优化参数。结果解读需结合磷酸化蛋白印迹(如GS Ser641位点磷酸化检测)进行综合分析。

通过精确控制G6P浓度区分酶的活化与非活化形式,此方法为研究糖原代谢的动态调控提供了可靠的技术支持。