己糖激酶(HK)检测 - 中析研究所生物检测中心

己糖激酶（HK）检测：原理、方法与临床应用

一、引言

己糖激酶（Hexokinase，简称 HK，EC 2.7.1.1）是糖代谢途径中的关键限速酶之一，广泛存在于生物体的各种组织细胞中（尤其在肝脏、肌肉、脑、脂肪组织及红细胞中活性较高）。它催化葡萄糖、果糖等己糖的磷酸化反应（通常以葡萄糖为主），生成相应的6-磷酸己糖（如葡萄糖-6-磷酸，G6P），这是糖酵解、磷酸戊糖途径和糖原合成的起始步骤。检测 HK 活性对于研究细胞能量代谢、相关疾病（如糖尿病、肿瘤）的病理生理机制、某些遗传性酶缺陷疾病的诊断（如 I 型糖原贮积症，GSD I，即 Von Gierke 病）以及评估组织活力等具有重要价值。

二、检测原理

目前实验室最常用的 HK 活性检测方法是基于 酶偶联比色法/分光光度法。其核心原理是利用 HK 催化的反应产物 G6P 作为底物，将其进一步耦联到葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）催化的反应中，通过监测 NADPH 的生成速率来间接反映 HK 的活性。

具体反应步骤如下：

HK 催化反应：
葡萄糖 + ATP → 葡萄糖-6-磷酸 (G6P) + ADP
G6PD 偶联反应：
葡萄糖-6-磷酸 (G6P) + NADP⁺ → 6-磷酸葡萄糖酸内酯 + NADPH + H⁺

检测指标： 在反应体系中加入过量的 ATP（HK 的底物）、NADP⁺（G6PD 的辅酶）以及足量的 G6PD。此时，HK 的活性成为整个反应体系的限速步骤。HK 活性越高，单位时间内生成的 G6P 就越多，进而被 G6PD 转化为 NADPH 的量也越多。
测定方法： NADPH 在 340 nm 波长处具有特征性吸收峰。使用分光光度计或生化分析仪，连续监测一定时间（通常 2-5 分钟）内反应混合物在 340 nm 波长处吸光度（A₃₄₀）的上升速率（ΔA/min）。该上升速率与 NADPH 的生成速率成正比，进而与样品中 HK 的活性成正比。
计算： HK 活性（U/L）通常根据以下公式计算：
HK 活性 = (ΔA₃₄₀ / min) * (反应总体积 / 样品体积) * (1000 / 消光系数)
其中：
- ΔA₃₄₀ / min：每分钟吸光度的变化值（斜率）。
- 反应总体积：反应混合物的总体积（单位：mL）。
- 样品体积：加入反应混合物中的样品体积（单位：mL）。
- 1000：单位换算系数（将 mL 转换为 L）。
- 消光系数：NADPH 在 340 nm、光程 1 cm 时的毫摩尔消光系数（通常为 6.22 L mmol⁻¹ cm⁻¹）。具体计算需参照所使用试剂盒或实验室标准操作规程。

三、样本采集与处理

样本类型：
- 血清/血浆： 常用于评估全身性或特定疾病状态下的 HK 活性变化（虽然血清/血浆中 HK 活性通常很低）。采集后需及时分离，避免溶血（红细胞含有高浓度 HK）。
- 红细胞溶血液： 主要用于诊断 HK 缺乏相关的溶血性贫血（相对罕见）。需使用肝素或 EDTA 抗凝血，经生理盐水洗涤红细胞数次去除白细胞和血小板后，裂解红细胞制成溶血液。此过程需严格操作，防止其他来源污染。
- 组织匀浆： 用于科研或特定病理分析（如肝脏活检）。组织需快速取材，用冰冷的生理盐水或缓冲液清洗，吸干后称重，在冰冷的匀浆缓冲液（含蛋白酶抑制剂）中充分匀浆，离心取上清液待测。整个过程需在冰上操作以保持酶活性。
- 培养细胞： 需收集细胞，用 PBS 清洗后，用裂解液裂解细胞，离心取上清液。
样本储存：
- 新鲜分离的血清/血浆和组织/细胞裂解上清液应在检测前置于 2-8°C 保存，并尽快（通常建议 24 小时内）检测。
- 若需长期保存，样本应分装后置于 -70°C 或更低温度冷冻。避免反复冻融，这会显著降低酶活性。

四、检测方法步骤（概要）

以下为使用商品化试剂盒进行血清/血浆或组织裂解液检测的一般流程（具体操作务必严格遵循所用试剂盒说明书或实验室 SOP）：

试剂准备： 根据说明书要求，将干粉试剂用指定体积的去离子水复溶，混匀平衡至室温（通常 25°C 或 37°C）。
分装： 取适量复溶好的工作试剂（含 ATP、NADP⁺、G6PD 等）加入比色皿或微孔板孔中。
预孵育： 将比色皿/微孔板置于已预热至检测温度（如 37°C）的分光光度计或酶标仪中，孵育数分钟使温度平衡。
加样启动反应： 加入准确体积（通常为 10-50 μL）的待测样本（血清/血浆/稀释的组织裂解上清液）或校准品/质控品，迅速混匀。
监测反应： 立即开始连续监测反应体系在 340 nm 波长处的吸光度变化（ΔA₃₄₀），持续监测 2-5 分钟（或说明书规定时间）。
计算活性： 记录线性反应期内每分钟吸光度的平均变化值（ΔA₃₄₀/min），代入公式计算 HK 活性。

五、结果解读与临床意义

参考范围： HK 活性的参考范围因检测方法、样本类型（血清、血浆、红细胞、组织）、实验室条件以及人群（年龄、性别）不同而存在较大差异。实验室应建立并使用自己验证的参考范围。 通常血清/血浆 HK 活性很低（参考值范围窄）。红细胞 HK 活性有特定的参考区间（通常远高于血浆）。组织 HK 活性通常以单位重量（如每克湿重或每毫克蛋白）的活性表示。
结果解读要点：
- 低于参考范围：
  - 遗传性 HK 缺乏症： 红细胞 HK 缺乏是一种罕见的常染色体隐性遗传病，可导致慢性非球形红细胞溶血性贫血（CNSHA）。确诊需结合基因检测。
  - 获得性 HK 活性降低： 某些严重肝病（如晚期肝硬化、肝衰竭）、某些恶性肿瘤晚期、长期营养不良或消耗性疾病状态可能伴随组织或血清 HK 活性降低，但临床特异性不高。某些药物或毒素也可能抑制 HK。
- 高于参考范围：
  - 肿瘤标志物探索： 研究发现，多种肿瘤（如肝癌、结直肠癌、乳腺癌等）组织中 HK（尤其是 HK-II 同工型）活性常显著升高，与肿瘤细胞的“瓦博格效应”（Warburg effect，即即使在有氧条件下也偏好糖酵解供能）密切相关。HK-II 被广泛认为是潜在的肿瘤代谢标志物和治疗靶点。血清/血浆 HK 活性在某些肿瘤患者中也可能升高，但其作为循环肿瘤标志物的敏感性和特异性仍在研究中。
  - 糖尿病研究： 在高血糖状态下，组织（如肝脏、肌肉、脂肪）中的 HK 活性或其基因表达可能发生适应性变化（升高或降低取决于组织类型和糖尿病阶段），参与胰岛素抵抗和糖代谢紊乱的病理过程。检测组织 HK 更多用于科研。
  - 组织损伤/炎症： 与许多胞内酶类似，组织损伤（如心肌梗死、肌肉损伤、肝炎）可能导致胞内 HK 释放入血，引起血清/血浆 HK 活性短暂升高。这种升高通常不具有疾病特异性。
  - 血液系统疾病： 某些白血病细胞或淋巴瘤细胞中 HK 活性可能异常增高。
注意事项：
- HK 存在四种主要同工酶（HK I-IV），它们在组织分布、动力学特性和生理功能上存在差异。标准的总 HK 活性检测无法区分同工酶类型。科研中可能需要使用特异性的抗体或分子生物学方法检测特定同工酶。
- 血清/血浆 HK 活性相对较低，结果容易受到多种因素干扰（见下文），解读需谨慎。
- 结果解读必须紧密结合患者的临床表现、病史、其他实验室检查（如血糖、胰岛素、HbA1c、溶血筛查、肝功能、肿瘤标志物、影像学等）进行综合判断。单一的 HK 检测结果通常不能作为确诊依据。

六、影响因素与质量控制

干扰因素：
- 溶血： 这是血清/血浆 HK 检测最主要的干扰因素。 红细胞含有极高浓度的 HK，轻微的溶血即可导致血清/血浆 HK 活性假性显著升高。样本采集和处理过程中必须严格避免溶血。
- 脂血： 严重脂血样本可能因浊度影响吸光度测定，需要高速离心去除脂质或设置适当的样品空白。
- 黄疸： 胆红素在 340 nm 附近也有吸收，高胆红素样本可能导致背景吸光度增高，需考虑设置血清空白或在检测波长处校正。
- 药物干扰： 某些药物可能抑制或诱导 HK 活性，需注意患者用药史。
- 储存条件： 不适当的储存（高温、反复冻融）会导致酶失活。
质量控制 (QC)：
- 室内质控（IQC）： 每批检测必须同时运行至少两个浓度水平（正常值和病理值）的质控品。结果应在控方可报告患者样本结果。绘制质控图（如 Levey-Jennings 图）进行日常监控。
- 室间质评（EQA）/能力验证（PT）： 定期参加由权威机构组织的 EQA/PT 计划，评估实验室检测结果的准确性和可比性。
- 校准： 定期使用可溯源的标准品或校准品对检测系统进行校准。
- 试剂与仪器维护： 确保试剂在有效期内且储存条件正确；定期对分光光度计/生化分析仪进行维护保养和性能验证（如波长准确性、吸光度准确性、温控精度）。
- 标准化操作规程（SOP）： 建立并严格执行详细的 SOP，覆盖样本采集、处理、储存、检测、计算、结果审核全过程。
- 人员培训： 确保操作人员经过充分培训，理解原理并能规范操作。

七、总结

己糖激酶（HK）检测，特别是基于酶偶联分光光度法，是评估糖代谢关键步骤酶活性的重要工具。它在基础代谢研究、遗传性酶缺陷疾病（如 HK 缺乏性贫血）的诊断、以及探索肿瘤等疾病发生发展的代谢机制（如瓦博格效应）中发挥着重要作用。准确可靠的检测结果依赖于严格的样本采集处理（尤其避免溶血）、规范化的操作流程、完善的质控体系以及对结果影响因素的充分认识。解读结果时，必须结合临床背景和其他辅助检查进行综合分析。科研领域对特定 HK 同工酶（如 HK-II）的深入研究，为理解疾病机制和开发新的诊疗策略提供了重要方向。