多聚半乳糖醛酸酶(PG)活性检测 - 中析研究所生物检测中心

多聚半乳糖醛酸酶(PG)活性检测方法

一、引言
多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase, PG, EC 3.2.1.15)是一种广泛存在于植物、真菌和细菌中的水解酶，专一性水解果胶类物质中α-1,4-糖苷键连接的聚半乳糖醛酸骨架，产生半乳糖醛酸或其寡聚体。PG活性在果实软化、植物组织脱落、病原微生物侵染及食品加工（如果汁澄清）等过程中起关键作用。准确测定PG活性对于基础研究和应用开发至关重要。本方法基于还原糖定量法（DNS法）建立，具有操作简便、成本低廉的优点。

二、实验原理
PG酶催化聚半乳糖醛酸（底物）水解，断裂糖苷键，生成具有还原性末端的寡聚半乳糖醛酸或半乳糖醛酸单体。这些还原糖在碱性、沸腾条件下能将3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂中的硝基还原为氨基，自身被氧化。生成的棕红色氨基化合物在540 nm波长处具有最大光吸收值，其吸光度与反应体系中还原糖的生成量成正比。通过测定单位时间内还原糖的生成量，即可计算PG酶活性。酶活性单位(U)定义为：在特定反应条件下（37°C，pH 5.0），每分钟催化产生1 μmol 还原糖（以半乳糖醛酸计）所需的酶量。

三、试剂与溶液

0.1 M 醋酸钠缓冲液(pH 5.0): 称取8.2 g三水合醋酸钠(CH₃COONa·3H₂O)，溶于约800 mL蒸馏水中，用冰醋酸调节pH至5.0，定容至1 L。
0.5% (w/v) 聚半乳糖醛酸钠溶液: 溶解0.5 g聚半乳糖醛酸钠于0.1 M醋酸钠缓冲液(pH 5.0)中，磁力搅拌至完全溶解，定容至100 mL。临用前配制或分装于-20°C保存。
DNS试剂:
- 甲液：溶解6.9 g结晶苯酚于15.2 mL 10% (w/v) 氢氧化钠溶液中，加蒸馏水稀释至69 mL。再加入6.9 g亚硫酸氢钠(NaHSO₃)。
- 乙液：溶解255 g酒石酸钾钠(KNaC₄H₄O₆·4H₂O)于300 mL 10% (w/v) 氢氧化钠溶液中，再加入880 mL 1% (w/v) 3,5-二硝基水杨酸水溶液。
- 将甲液缓慢加入乙液中，充分混合均匀。贮于棕色瓶中，避光室温放置一周后使用，有效期为6个月。
酶液: 根据样品来源（如植物组织提取液、微生物发酵液或纯化酶液），用预冷的0.1 M醋酸钠缓冲液(pH 5.0)提取或适当稀释至预期活性范围内。建议预实验确定最佳稀释倍数。
半乳糖醛酸标准溶液(1 mM): 精确称取21.2 mg D-(+)-半乳糖醛酸单水合物(分子量212.16)，用0.1 M醋酸钠缓冲液(pH 5.0)溶解并定容至100 mL。此溶液为10 mM储备液。临用前用缓冲液稀释成0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6 mM的标准工作液。

四、仪器与设备

恒温水浴锅 (37°C ± 0.5°C 和沸水浴)
紫外-可见分光光度计
微量移液器 (10 μL, 100 μL, 1000 μL)
试管 (具塞或普通试管，15 mL)
试管架
计时器
离心机 (用于样品前处理)
pH计
分析天平
磁力搅拌器
冰水浴

五、实验步骤

标准曲线的制备:

取6支洁净试管，按下表加入试剂：

试管号	0.1 M醋酸钠缓冲液 (mL)	半乳糖醛酸标准工作液 (mL)	最终浓度 (mM)	还原糖量 (μmol)
0 (空白)	1.0	0	0	0
1	0.9	0.1 (0.1 mM)	0.01	0.01
2	0.8	0.2 (0.2 mM)	0.02	0.02
3	0.7	0.3 (0.3 mM)	0.03	0.03
4	0.6	0.4 (0.4 mM)	0.04	0.04
5	0.5	0.5 (0.5 mM)	0.05	0.05
6	0.4	0.6 (0.6 mM)	0.06	0.06

向每支试管中加入1.0 mL DNS试剂，立即混匀。
将试管置于沸水浴中，精确加热5分钟。
取出试管，立即置于冰水浴中冷却至室温。
每管加入4.0 mL蒸馏水，充分混匀。
以0号管（空白）调零，在540 nm波长下测定各管的吸光度值(A₅₄₀)。
以吸光度值(A₅₄₀)为纵坐标(y)，对应的还原糖量(单位为μmol)为横坐标(x)，绘制标准曲线，求得线性回归方程(y = mx + b)及其相关系数(R²)。R²应大于0.99。

样品PG活性测定:
- 酶促反应： 取两支试管（或两个平行），标记为：
  - 测定管(S): 加入0.5 mL 0.5% 聚半乳糖醛酸钠溶液（底物），置于37°C水浴中预热5分钟。
  - 对照管(C): 加入0.5 mL 0.1 M醋酸钠缓冲液(pH 5.0)，置于37°C水浴中预热5分钟。
- 预热结束后，向测定管(S) 中加入0.5 mL适当稀释的酶液；向对照管(C) 中加入0.5 mL适当稀释的酶液（注意：对照管仅加入缓冲液而非底物，用于扣除酶液本身可能含有的还原糖背景）。
- 立即混匀，启动计时器，在37°C水浴中精确反应30分钟。
- 反应结束后，立即向每管加入1.0 mL DNS试剂（提前预热至室温），迅速混匀以终止反应。
- 显色与测定：
  - 将终止反应后的所有试管（包括标准曲线管、测定管、对照管）同时置于沸水浴中，精确加热5分钟。
  - 取出试管，立即置于冰水浴中冷却至室温。
  - 向每管中加入4.0 mL蒸馏水，充分混匀。
  - 以标准曲线0号管（空白）调零，在540 nm波长下测定所有样品的吸光度值(A₅₄₀)。

六、结果计算

根据测定的对照管吸光度(Ac) 和 测定管吸光度(As)，利用标准曲线方程计算出对应的还原糖量：
- 对照管还原糖量(C_s, μmol) = (A_c - b) / m
- 测定管还原糖量(S_s, μmol) = (A_s - b) / m
- 其中，m为标准曲线斜率，b为截距。
计算酶催化产生的净还原糖量：
- 净还原糖量(S_net, μmol) = S_s - C_s
计算PG酶活性：
- PG活性 (U/mL) = (S_net × D) / (V × T)
- 式中：
  - S_net: 净生成的还原糖量 (μmol)
  - D: 酶液在反应体系中的总稀释倍数 (反应体系中酶液体积为0.5 mL，需考虑提取稀释倍数)
  - V: 反应体系中加入的酶液体积 (L)，此处V = 0.5 mL = 0.0005 L
  - T: 酶促反应时间 (min)，此处T = 30 min
- 简化公式：
  - PG活性 (U/mL) = (S_net × D) / (0.0005 × 30) = (S_net × D) / 0.015
- PG活性单位(U)定义： 在上述条件下，每分钟产生1 μmol还原糖（以半乳糖醛酸计）所需的酶量为1个活力单位。
若测定的是组织匀浆液，结果常表示为比活力：
- 比活力 (U/mg prot) = PG活性 (U/mL) / 酶液蛋白浓度 (mg prot/mL)
- 酶液蛋白浓度需用Bradford法或Lowry法等其他蛋白定量方法测定。

七、注意事项

关键控制点： 反应时间、水浴温度（37°C和沸水浴）、DNS加入量、沸水浴时间（5分钟）必须精确控制。
底物: 聚半乳糖醛酸钠溶液建议临用前配制或在-20°C分装保存，避免降解。确保溶解完全无沉淀。
酶液: 酶液浓度需通过预实验稀释至适当范围，使反应后测得的A₅₄₀落在标准曲线的线性范围内（通常建议0.2-0.8）。酶液应置于冰上操作，避免失活。
DNS试剂： 配制过程需小心操作（含浓碱）。储存于棕色瓶避光保存，颜色变深或产生沉淀应弃用。确保DNS试剂与样品充分混合后再沸水浴。
背景扣除： 对照管（C管）至关重要，用于扣除酶液本身含有的还原糖及DNS试剂颜色本底。空白管（标准曲线0号管）仅含缓冲液和DNS，用于仪器调零。
标准曲线： 每次实验必须随行制作新的标准曲线，因为显色条件可能存在微小差异。
线性范围： 确保最终测定的A₅₄₀值在标准曲线的线性范围内，否则需调整酶液浓度或反应时间重新测定。
酶失活： PG酶对温度敏感，酶液应置于冰上保存，稀释过程应在低温环境下快速进行。
安全： 配制DNS试剂和沸水浴操作时注意高温和化学品（苯酚、浓碱）防护，穿戴实验服、手套和护目镜。

八、方法评价与讨论

DNS法测定PG活性是一种广泛应用的经典方法，优缺点如下：

优点：
- 原理清晰，操作相对简便，无需特殊仪器（仅需分光光度计）。
- 试剂成本低廉，易于获取。
- 适用于大量样品的快速筛选。
局限性：
- 特异性较低： DNS法测定的是总还原糖含量，若样品中除PG水解产物外还含有其他还原糖物质（如葡萄糖、果糖等），会导致结果偏高。需确保对照管能有效扣除本底。
- 灵敏度和线性范围： 相较于一些更灵敏的方法（如Nelson-Somogyi法或酶法），DNS法的灵敏度略低。反应产物浓度需在线性范围内。
- 底物限制： 使用聚半乳糖醛酸钠作为底物主要反映的是内切PG或兼具内切外切活性的PG的总水解活性。如需区分内切和外切PG活性，可能需要选用不同底物（如寡聚半乳糖醛酸）或采用其他方法（如果胶粘度法用于内切PG）。
- 沸水浴操作： 高温操作需小心，且可能导致样品间微小温差。

结论：
本方法提供了一种基于DNS还原糖定量的、可靠的测定多聚半乳糖醛酸酶(PG)活性的标准化流程。严格遵守操作步骤和注意事项，特别是精确控制反应时间、温度和显色条件，并严格设置对照管和随行标准曲线，是获得准确、重现性好的PG活性数据的关键。该方法适用于植物组织、微生物培养物及食品样品中PG活性的常规检测。研究人员可根据具体实验目的和要求选用此法或结合其他方法进行更深入的分析。