脂肪酸合成酶(FAS)活性检测

脂肪酸合成酶(FAS)活性检测方法详解

一、引言

脂肪酸合成酶(FAS)是催化脂肪酸从头合成(de novo lipogenesis)的关键限速酶。它存在于细胞质中，通过一系列连续的催化反应，利用乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A作为底物，在还原型辅酶II(NADPH)和ATP的参与下，最终合成棕榈酸。FAS活性与脂质代谢密切相关，其异常表达或活性改变参与肥胖、2型糖尿病、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、心血管疾病以及多种肿瘤的发生发展。因此，准确检测FAS活性对于研究脂质代谢调控机制、相关疾病病理生理过程以及药物筛选评价均具有重要意义。

二、实验原理

FAS活性的检测主要基于其催化反应过程中NADPH的消耗。NADPH在340 nm波长处具有特征性吸收峰。在FAS催化的脂肪酸合成反应中，每延长一个二碳单位（由丙二酰辅酶A提供）并还原成亚甲基，需要消耗2分子NADPH。

标准检测反应通常包含以下关键组分：

• 底物： 乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A
• 辅因子： NADPH
• 辅助因子： Mg²⁺、K⁺等
• 缓冲体系： 磷酸钾缓冲液(pH 7.0)或Tris-HCl缓冲液
• 酶源： 组织匀浆上清液、细胞裂解液或纯化的FAS酶

反应启动后，FAS利用NADPH提供的还原力，催化乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A合成脂肪酸。随着反应的进行，NADPH被氧化成NADP⁺，导致反应体系中NADPH的浓度下降，其在340 nm处的吸光度值(A₃₄₀)随之线性降低。通过监测单位时间内A₃₄₀的下降值(ΔA₃₄₀/min)，即可计算出FAS的催化活性。

三、实验材料与试剂

1. 样品：
   • 动物组织(如肝脏、脂肪组织)：迅速取出，预冷生理盐水冲洗，滤纸吸干，称重后置于预冷的匀浆缓冲液中。
   • 培养细胞：胰酶消化收集，预冷PBS洗涤，离心沉淀后重悬于裂解缓冲液中。
   • 微生物：离心收集菌体，洗涤后重悬于缓冲液中进行破碎。
2. 匀浆/裂解缓冲液： (示例：0.1 M 磷酸钾缓冲液，pH 7.4，含1 mM EDTA，1 mM DTT，蛋白酶抑制剂混合物)。DTT用于维持酶蛋白巯基还原状态，EDTA螯合金属离子，蛋白酶抑制剂防止酶降解。
3. FAS反应缓冲液(临用前配制)：
   • 0.1 M 磷酸钾缓冲液(pH 7.0)
   • 1 mM EDTA
   • 1 mM DTT
   • 2 mM NADPH
   • 10 mM 乙酰辅酶A
   • 25 µM 丙二酰辅酶A (注意：丙二酰辅酶A浓度需优化，过高可能抑制)
   • 10 mM MgCl₂
   • 50 mM KCl
4. 蛋白浓度测定试剂： Bradford法或BCA法所需试剂。
5. 仪器设备：
   • 预冷离心机
   • 组织匀浆器或超声细胞破碎仪
   • 分光光度计(需有恒温比色槽)
   • 恒温水浴锅
   • 移液器及枪头
   • 比色皿(石英或塑料，光径1 cm)
   • 冰盒
   • 计时器

四、实验步骤

1. 样品制备：
   • 组织样品： 将称重的组织置于预冷的匀浆缓冲液中(通常按重量体积比1:5~1:10，w/v)，冰浴条件下充分匀浆。将匀浆液在4°C下以10,000~15,000 g离心15-30分钟。小心吸取上清液(即含有FAS的细胞质组分)，置于冰上备用。注意： 操作全程需在冰上进行，以最大限度保持酶活性。
   • 细胞样品： 细胞沉淀用预冷的裂解缓冲液重悬(体积根据细胞量调整)，冰浴超声破碎或反复冻融裂解细胞。然后在4°C下以12,000-15,000 g离心15分钟，取上清液置于冰上备用。
   • 微生物样品： 类似细胞样品处理方法。
2. 蛋白浓度测定： 采用Bradford法或BCA法测定样品上清液的蛋白质浓度。
3. 反应体系设置(以1 ml比色皿为例)：
   • 在预热的比色皿中加入 0.9 ml 预热的FAS反应缓冲液。
   • 将比色皿放入已恒温(通常为37°C)的分光光度计比色槽中，平衡3-5分钟。
   • 加入 0.1 ml 预冷的样品上清液(或适当稀释的样品)，迅速轻柔混匀(避免产生气泡)。
   • 立即盖上比色皿盖，启动计时器。
4. 吸光度监测：
   • 在340 nm波长处，每隔30秒或1分钟记录一次吸光度值(A₃₄₀)，持续监测5-10分钟(或直到观察到稳定的线性下降)。
   • 关键： 确保反应体系温度恒定(通常37°C)，并设置空白对照(用等体积的匀浆/裂解缓冲液代替样品上清液加入反应体系，监测其A₃₄₀变化，用于校正非特异性变化)。
5. 终止反应： 通常不需要特定终止，监测足够时间后自然结束。

五、结果计算

1. 计算ΔA₃₄₀/min： 选择反应曲线中线性下降最稳定的阶段(通常是最初的3-6分钟)，计算每分钟吸光度的下降值(ΔA₃₄₀/min)。若空白对照有变化，需从样品ΔA₃₄₀/min中减去空白ΔA₃₄₀/min，得到校正后的ΔA₃₄₀/min。
2. 应用消光系数： NADPH在340 nm处的摩尔消光系数(ε)为6.22 × 10³ M⁻¹ cm⁻¹。
3. 计算酶活性：
   • 酶活性单位定义：在特定条件下(37°C, pH 7.0)，每分钟催化消耗1 nmol NADPH所需的酶量定义为一个活性单位(U)。
   • 计算公式：
     FAS活性 (nmol/min/mg prot) = (ΔA₃₄₀/min × 反应总体积(ml) × 1000) / (ε × 比色皿光径(cm) × 样品蛋白浓度(mg/ml) × 样品体积(ml))
   • 公式解读：
     • ΔA₃₄₀/min：校正后每分钟吸光度变化值。
     • 反应总体积(ml)：比色皿中反应混合物的最终体积(如1.0 ml)。
     • 1000：将nmol转换为mol的系数(因为ε是M⁻¹ cm⁻¹，即L/mol/cm)。
     • ε：NADPH的摩尔消光系数，6.22 × 10³ L/mol/cm (或6.22 × 10³ M⁻¹ cm⁻¹)。
     • 比色皿光径(cm)：通常为1 cm。
     • 样品蛋白浓度(mg/ml)：样品上清液的蛋白质浓度。
     • 样品体积(ml)：加入反应体系中的样品体积(如0.1 ml)。

六、注意事项与优化

1. 样品新鲜度与低温操作： FAS对温度敏感，组织离体后应尽快处理，匀浆、离心等操作全程需在冰上进行。制备好的上清液应尽快检测，避免反复冻融。
2. 底物浓度优化： 乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A的浓度对反应速率影响显著。特别是丙二酰辅酶A，浓度过高会产生底物抑制效应。建议进行预实验确定最佳浓度范围(通常乙酰辅酶A 10-50 µM, 丙二酰辅酶A 10-50 µM)。
3. 酶量选择： 样品蛋白加入量应使ΔA₃₄₀/min控制在0.01-0.05/min范围内，以保证反应在线性区间进行。可通过稀释样品来调整。
4. 严格控制温度： 反应温度直接影响酶活性和反应速率，分光光度计的比色槽必须精确控温(常用37°C)。
5. 避免干扰： 确保使用的缓冲液、试剂(特别是辅酶和酰基辅酶A)纯度高且新鲜配制。NADPH见光易分解，应避光保存和使用。金属离子、去污剂等可能影响酶活。
6. 空白对照： 设置包含所有反应组分(仅用缓冲液代替样品)的空白对照至关重要，用于扣除非特异性NADPH消耗或光散射等背景干扰。
7. 线性验证： 确保在选定的监测时间内，ΔA₃₄₀与时间呈良好的线性关系，这是计算结果准确的前提。

七、应用

FAS活性检测广泛应用于：

• 基础研究： 探究营养状态(饥饿/饱食)、激素(胰岛素、胰高血糖素、瘦素等)、基因表达调控对脂质合成的分子机制。
• 疾病研究： 评估肥胖、胰岛素抵抗、2型糖尿病、非酒精性脂肪肝(NAFLD)、动脉粥样硬化、某些癌症(如前列腺癌、乳腺癌)等代谢紊乱疾病中FAS活性的变化及其在发病中的作用。
• 药物研发与评价： 筛选和评价能够调节FAS活性的潜在降脂、抗肥胖或抗肿瘤药物。
• 微生物代谢工程： 优化产油微生物或工程菌株的脂肪酸合成能力。

八、总结

基于NADPH在340 nm吸光度变化的紫外分光光度法是检测脂肪酸合成酶(FAS)活性最经典、最常用的方法。该方法原理清晰、操作相对简便、成本较低，适用于多种生物样本(组织、细胞、微生物)。通过严格控制实验条件(低温操作、优化底物浓度、精确控温、设置空白对照、保证反应线性)，可以获得可靠、可重复的FAS活性数据，为深入理解脂质代谢调控及相关疾病的研究提供重要的实验依据。