丙酮酸脱羧酶(PDC)活性检测

发布时间：2025-06-27 15:37:49 阅读量：2 作者：生物检测中心

丙酮酸脱羧酶（PDC）活性检测方法

丙酮酸脱羧酶（Pyruvate decarboxylase, PDC; EC 4.1.1.1）是糖酵解途径中的关键酶之一，尤其在酵母等微生物的乙醇发酵过程中扮演核心角色。它催化丙酮酸不可逆地脱羧生成乙醛，并释放二氧化碳（CO₂）。PDC活性检测对于研究能量代谢、发酵过程、微生物生理以及某些代谢性疾病（如硫胺素缺乏症）具有重要意义。以下是一种基于分光光度法的、广泛使用的PDC活性检测方案。

一、 检测原理

本方法基于PDC催化丙酮酸脱羧生成乙醛的反应。检测体系中引入醇脱氢酶（Alcohol dehydrogenase, ADH; EC 1.1.1.1）和还原型辅酶I（NADH）。ADH利用NADH作为辅因子，将PDC产生的乙醛进一步还原为乙醇，同时NADH被氧化为NAD⁺。该过程伴随NADH在340 nm波长处吸光度（A₃₄₀）的下降。由于NADH的消耗量与PDC催化产生的乙醛量（进而与丙酮酸的消耗量）成正比，因此通过监测单位时间内A₃₄₀的下降速率，即可计算PDC的酶活性。

 
 
 
反应式： 1. PDC: 丙酮酸 → 乙醛 + CO₂ 2. ADH: 乙醛 + NADH + H⁺ → 乙醇 + NAD⁺ ----------------------------------------- 总反应：丙酮酸 + NADH + H⁺ → 乙醇 + CO₂ + NAD⁺

二、 主要试剂与溶液配制

  • 缓冲液 (Buffer):
    • 推荐使用 50-100 mM HEPES 缓冲液 (pH 6.8-7.2) 或 50 mM 磷酸钾缓冲液 (pH 6.5-7.0)。
    • 配制：准确称量适量缓冲盐，用蒸馏水溶解，以HCl或KOH调节至所需pH，定容。4°C保存。
  • 硫胺素焦磷酸 (Thiamine pyrophosphate, TPP): PDC的必需辅因子。
    • 配制：10-50 mM 水溶液。新鲜配制或分装后-20°C避光保存（避免反复冻融）。
  • 氯化镁 (MgCl₂): 重要的激活剂。
    • 配制：100-200 mM 水溶液。室温或4°C保存。
  • 还原型辅酶I (β-NADH):
    • 配制：10-20 mM β-NADH水溶液（溶于适量上述缓冲液或水中）。由于NADH对空气氧化敏感，需新鲜配制（或分装后-70°C保存，临用前融化），溶液呈淡黄色为可用状态，若变棕色则失效。
  • 丙酮酸 (Sodium pyruvate): 底物。
    • 配制：100-200 mM 水溶液（可用缓冲液溶解）。新鲜配制或分装后-20°C保存。
  • 醇脱氢酶 (ADH):
    • 来源：通常使用酵母来源的ADH悬液。根据需要，用上述缓冲液稀释至适宜浓度（例如300-600 U/mL）。活性单位(U)定义通常为：在pH 7.5, 25°C条件下，每分钟氧化1 μmol NADH所需的酶量。具体稀释倍数需根据供应商提供的比活和检测体系优化。临用前稀释，冰浴放置。
  • 待测酶液 (Enzyme extract):
    • 样品制备：根据样本来源（如酵母、植物组织、细胞裂解液等），采用匀浆、超声波破碎、冻融裂解等方法制备粗提液或部分纯化液。离心（如12, 000 g, 4°C, 15-20 min）取上清作为酶液。蛋白质浓度常用Bradford或BCA法测定。检测前用适量缓冲液稀释至预期活性范围内（通常需要预实验确定最佳稀释倍数），冰浴放置。
  • 终止液 (可选): 若进行终点法检测，需配制强酸（如1-2 M HCl）或强碱溶液用于终止反应。
 

三、 所需仪器

  1. 紫外-可见分光光度计
  2. 恒温比色杯架或带温控的分光光度计（推荐）
  3. 精密移液器及配套吸头
  4. 石英比色杯（光程通常为1 cm）
  5. 计时器
  6. 冰盒
  7. 涡旋振荡器
  8. 离心机 (用于样品前处理)
 

四、 检测步骤 (动力学法 - 推荐)

  1. 预温育： 将分光光度计比色杯槽预热至设定检测温度（通常是25°C, 30°C或37°C，需在报告中注明）。预热缓冲液、TPP、MgCl₂溶液至检测温度。
  2. 配制反应混合液 (主混合液, Master Mix)： 在冰上或室温（根据稳定性）按以下顺序混合除酶液和底物外的所有组分（按单次反应体积计算，通常最终反应体积为1 mL）：
    • 缓冲液：适量（确保最终体积准确）
    • TPP溶液：终浓度 0.1-0.5 mM
    • MgCl₂溶液：终浓度 1-5 mM
    • NADH溶液：终浓度 0.1-0.2 mM
    • ADH溶液：终浓度 1-2 U/mL (确保ADH活性充足，反应速率由PDC决定)
    • 蒸馏水：补足体积至反应总体积减去酶液和丙酮酸体积之和。
    • 充分混匀后，置于设定温度下平衡几分钟。
  3. 空白对照设置 (Blank)：
    • 取一个干净的比色杯，加入所需体积的预热反应混合液。
    • 加入与待测酶液等体积的缓冲液（代替酶液）。
    • 加入丙酮酸溶液启动反应（终浓度通常为10-20 mM）。迅速轻柔混匀（避免产生气泡），立即放入已预热的比色槽中。
    • 立即开始监测A₃₄₀随时间的变化（连续监测模式），持续1-2分钟。记录基线斜率（ΔA₃₄₀/min₋ᵦₗₐₙₖ）。该斜率应非常小（接近0），反映NADH的非酶降解或ADH背景活性。若过大，需检查NADH或ADH是否失活。
  4. 样品反应设置 (Sample)：
    • 另取一个干净的比色杯，加入所需体积的预热反应混合液。
    • 加入适量预热（或室温）的待测酶液。
    • 轻柔混匀，在设定温度下孵育1-2分钟（使酶适应温度）。
    • 加入预热（或室温）的丙酮酸溶液启动反应（终浓度通常为10-20 mM）。迅速轻柔混匀（避免产生气泡），立即放入已预热的比色槽中。
    • 立即开始连续监测A₃₄₀随时间的变化（通常监测1-5分钟）。确保记录初速度（即反应开始后线性最好的一段，通常前30-90秒）。记录线性下降阶段的斜率（ΔA₃₄₀/minₛₐₘₚₗₑ）。
  5. 重复： 每个样品应设置至少2-3次平行测定。
 

五、 数据处理与活性计算

  1. 计算净反应速率 (ΔA₃₄₀/minₙₑₜ)：
    ΔA₃₄₀/minₙₑₜ = ΔA₃₄₀/minₛₐₘₚₗₑ - ΔA₃₄₀/min₋ᵦₗₐₙₖ

  2. 计算PDC活性：
    PDC活性定义为：在特定条件下，每分钟催化转化1 μmol丙酮酸（或生成1 μmol乙醛/CO₂，或消耗1 μmol NADH）所需的酶量。

    • 基于NADH消耗的计算：
      PDC活性 (U/mL) = (ΔA₃₄₀/minₙₑₜ × Vᵣₓₙ × DF) / (ε × L × Vₑₙz)
      PDC比活 (U/mg) = PDC活性 (U/mL) / 蛋白浓度 (mg/mL)
    • 其中：
      • ΔA₃₄₀/minₙₑₜ：净吸光度变化速率 (min⁻¹)
      • Vᵣₓₙ：反应总体积 (mL)
      • DF：酶液在反应体系中的稀释倍数 (酶液原液体积 / 加入到反应体系中的酶液体积)
      • ε：NADH在340 nm波长处的摩尔消光系数 (L·mol⁻¹·cm⁻¹)。标准值为 6220 L·mol⁻¹·cm⁻¹ (pH 7-8)。请根据实际使用的缓冲液pH确认（不同pH下ε值略有差异，pH 7.0时约为6220，pH 7.5时约为6310）。
      • L：比色杯光程 (cm)，通常为1 cm。
      • Vₑₙz：加入到反应体系中的酶液体积 (mL)
      • 蛋白浓度：酶液原液的蛋白质浓度 (mg/mL)
    • 单位说明：
      • U/mL：每毫升酶原液所含的酶活性单位数。
      • U/mg：每毫克酶蛋白所含的酶活性单位数（比活力）。
      • μmol/min/mL 或 μmol/min/mg：与 U/mL 或 U/mg 意义等同。
 

六、 关键注意事项

  1. 温度控制： 酶促反应对温度敏感，必须严格控制并在报告中记录检测温度。预热所有试剂和比色杯至关重要。
  2. 试剂稳定性： NADH易氧化失效，必须新鲜配制或妥善保存。TPP也对光和热敏感。ADH悬液需按说明保存和稀释。
  3. 酶液制备与稀释： 保持酶液在冰浴中，避免长时间放置。稀释倍数需要优化，使检测到的ΔA₃₄₀/minₛₐₘₚₗₑ在线性范围内（通常0.01-0.1 /min为宜）。
  4. 底物浓度： 丙酮酸浓度应达到饱和（通常在10-20 mM）。过低会影响反应速率；过高可能导致底物抑制（虽不常见）或高酸度。可通过米氏动力学实验确定最适底物浓度。
  5. 辅因子与激活剂： TPP和Mg²⁺是PDC必需的。确保其在反应体系中的终浓度足够。
  6. ADH活性和控制： ADH活性必须大大过量，确保PDC步骤是速率限制步骤。空白对照用于扣除NADH自发氧化和ADH背景活性。
  7. 混合与读数： 加入启动试剂后需快速轻柔混合均匀并立即开始读数，确保捕获反应初速度。避免比色杯内产生气泡干扰光路。
  8. 线性范围： 确保分析的速率数据取自吸光度变化线性良好的阶段（R² > 0.99）。
  9. pH值： 缓冲液的pH对PDC活性影响显著。不同来源的PDC最适pH可能不同（酵母PDC约pH 6.5）。需优化并严格保持一致。
  10. 离子强度： 高离子强度可能抑制某些PDC活性。优化缓冲液浓度。
 

七、 方法应用与意义

该分光光度法灵敏度高、操作相对简便、成本较低，广泛应用于：

  • 基础研究： 阐明PDC在糖代谢、发酵调控中的作用机制。
  • 酶学性质研究： 测定PDC的动力学参数（Km丙酮酸, Vmax）、最适pH/pH稳定性、最适温度/热稳定性、抑制剂/激活剂效应等。
  • 微生物生理研究： 分析不同菌株、不同培养条件下（如碳源、氧分压）酵母或细菌中PDC的表达和活性变化。
  • 代谢工程： 评估改造菌株（高产乙醇、其他代谢物）中PDC活性的变化。
  • 临床研究（间接）： 研究硫胺素（维生素B₁）缺乏状态（脚气病、韦尼克脑病），因为TPP是其活性形式，缺乏会导致PDC等多种脱羧酶功能障碍。
 

八、 替代方法简述

  • 终点法： 反应进行固定时间后加入强酸（如三氯乙酸）或强碱终止反应，再测定生成的乙醛（常用方法如与2, 4-二硝基苯肼DNPH反应生成腙，在碱性条件下显色测定A₅₄₀）或剩余的丙酮酸。操作较繁琐，准确性稍逊于动力学法。
  • CO₂捕获法： 利用瓦氏呼吸仪或放射性同位素¹⁴C标记底物检测释放的CO₂。特异性强，但仪器要求高或涉及放射性。
  • 偶联其他指示系统： 如使用吩嗪硫酸甲酯(PMS)和碘硝基四唑紫(INT)等电子受体与NADH氧化偶联，产生可被比色测定的甲臜(formazan)。灵敏度更高，但体系更复杂。
 

结论：

基于NADH氧化分光光度法的PDC活性检测是一种可靠、灵敏且应用广泛的标准化方法。严格遵守操作细节，特别是控制温度、保证试剂（尤其是NADH、TPP、ADH）活性和使用线性范围内的反应速率，是获得准确、可重复结果的关键。该方法为深入研究丙酮酸代谢调控及相关生物技术和医学问题提供了有力的工具。