柠檬酸合酶(CS)活性检测方法
一、 引言
柠檬酸合酶(Citrate Synthase, CS,EC 4.1.3.7)是三羧酸循环(TCA循环或Krebs循环)中的第一个限速酶,催化草酰乙酸(Oxaloacetate)与乙酰辅酶A(Acetyl-CoA)缩合生成柠檬酸(Citrate)和辅酶A(CoA-SH)。其活性是评估细胞线粒体功能、代谢状态(尤其是有氧氧化能力)以及细胞活力和增殖状态的关键指标,在生物能量代谢、病理生理研究(如神经退行性疾病、肌肉疾病、癌症等)中具有重要意义。本研究采用基于分光光度法的标准检测方案。
二、 实验原理
本方法利用柠檬酸合酶催化的反应及其偶联反应进行检测:
- 主反应:
草酰乙酸 + 乙酰辅酶A + H₂O --> 柠檬酸 + 辅酶A(CoA-SH)
- 偶联显色反应: 利用5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)与反应生成的辅酶A(CoA-SH)迅速反应,生成黄色的5-硫代-2-硝基苯甲酸阴离子(TNB²⁻)。
CoA-SH + DTNB --> CoA-SS-TNB + TNB²⁻ (黄色)
- 检测原理: TNB²⁻在波长412 nm处具有强吸收峰。通过连续监测412 nm波长下吸光度(A₄₁₂)随时间上升的速率(ΔA₄₁₂/min),该速率与反应中产生的CoA-SH量成正比,进而与柠檬酸合酶的催化活性成正比。
三、 主要试剂与材料
- 缓冲液: Tris-HCl缓冲液(100 mM, pH 8.0,含0.1% Triton X-100)。或根据样本类型优化的其他缓冲液(如含EDTA等)。
- 底物溶液:
- 草酰乙酸(Oxaloacetate, OAA):临用前配制,浓度一般为0.5-1.0 mM(溶于上述缓冲液或水中)。注意:OAA在水溶液中不稳定,需冷藏避光,尽快使用。
- 乙酰辅酶A(Acetyl-CoA):临用前配制,浓度一般为0.2-0.3 mM(溶于冰水中)。冷冻储存,避免反复冻融。
- 显色剂: 5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB):浓度一般为0.1-0.2 mM(溶于上述缓冲液或专用配制液)。
- 标准品(可选): 辅酶A(CoA-SH)标准溶液,用于制作标准曲线或验证反应效率。
- 待测样本: 组织匀浆液(需用适当缓冲液匀浆并离心取上清)、细胞裂解液(需优化裂解条件)、纯化的酶溶液或线粒体提取物等。样本需保持低温(冰浴),避免反复冻融。
- 其他: 双蒸水(ddH₂O)。
四、 仪器设备
- 紫外-可见分光光度计(具备恒温比色皿架)
- 恒温水浴锅
- 微量移液器及配套枪头
- 石英或玻璃比色皿(光程通常为1 cm)
- 离心机(用于样本前处理)
- 涡旋振荡器
- 计时器
- 冰盒
五、 操作步骤(以96孔板或1 mL体系为例)
- 预热: 开启分光光度计,设定温度至30°C(或文献/实验要求温度,常用25-37°C),预热恒温装置。将所需试剂(除底物和样本外)平衡至检测温度。
- 反应体系配制(终体积1 mL):
- 在一个干净的比色皿中依次加入:
- 缓冲液: 940 μL
- DTNB溶液(0.2 mM): 50 μL (终浓度约0.01 mM)
- 乙酰辅酶A溶液(0.3 mM): 10 μL (终浓度约3 μM)
- 轻柔混匀。
- 在一个干净的比色皿中依次加入:
- 基线测定: 将比色皿放入已恒温的分光光度计中,在412 nm波长下读取吸光度(A₄₁₂),稳定1-2分钟,直至读数稳定。记录此值为基线值(通常接近0)。
- 启动反应:
- 快速加入: 吸取适量待测样本(通常为5-20 μL组织/细胞裂解上清液,需根据酶活预实验调整体积,确保反应速率在线性范围内)加入比色皿。
- 立即混匀: 迅速用移液器吹打混匀数次或加盖后轻微颠倒混匀(避免产生气泡)。
- 开始监测: 立即开始计时并连续监测412 nm吸光度(A₄₁₂)的变化,至少持续2-5分钟(或直到获得足够线性部分的数据点)。设定仪器记录间隔为10-60秒。
- 加入启动剂: (关键步骤) 在反应混合液预孵育1分钟后(使反应体系达到温度平衡并建立稳定的较低速率基线),加入草酰乙酸溶液(0.5 mM)10 μL(终浓度5 μM),迅速混匀。这是反应启动的标志性步骤。
- 对照组设置:
- 样本空白: 用等体积的缓冲液代替样本加入反应体系。
- 试剂空白(可选): 用等体积的缓冲液代替样本和底物(草酰乙酸)加入反应体系。
- 无乙酰辅酶A对照(可选,用于验证乙酰辅酶A依赖性): 用缓冲液代替乙酰辅酶A溶液。
六、 数据处理与计算
- 绘制反应曲线: 以时间(min)为横坐标,A₄₁₂为纵坐标绘制反应进程曲线。
- 确定反应速率: 选择反应开始后OD值线性上升的一段(通常为加入草酰乙酸后30秒至2分钟之间),计算该时间段内每分钟吸光度的变化值(ΔA₄₁₂/min)。样本的ΔA₄₁₂/min需减去对应对照组(通常是样本空白)的ΔA₄₁₂/min值,得到校正后的反应速率ΔA/min。
- 计算酶活性:
- 摩尔消光系数法: TNB²⁻在412 nm处的摩尔消光系数(ε₄₁₂)为13,600 M⁻¹cm⁻¹。
- 酶活性定义: 一个柠檬酸合酶活力单位(U)是指在特定测定条件下(温度、pH),每分钟催化生成1 μmol CoA-SH(即1 μmol TNB²⁻)所需的酶量。
- 计算公式:
酶活性 (U/mL) = (ΔA/min * Vt * Dil) / (ε * d * Vs) 酶活性 (U/mg蛋白) = [酶活性 (U/mL)] / [样本蛋白浓度 (mg/mL)]
* ΔA/min: 校正后的每分钟吸光度变化值 (ΔA₄₁₂/min) * Vt: 反应体系总体积 (mL),例如 1.0 mL * Dil: 样本在检测体系中的稀释倍数(若样本直接加入未稀释,则为1;若为稀释后加入,需计算稀释因子) * ε: TNB²⁻的摩尔消光系数 (13,600 M⁻¹cm⁻¹ = 13,600 L mol⁻¹ cm⁻¹) * d: 比色皿光程 (cm),通常为1 cm * Vs: 加入反应体系中的样本体积 (mL),例如 0.01 mL (10 μL) * **样本蛋白浓度:** 需使用标准方法(如BCA法、Bradford法)单独测定,单位为 mg/mL。
七、 注意事项
- 样本制备: 匀浆/裂解过程需温和、快速、持续低温(冰浴),使用适当的缓冲液(常含蛋白酶抑制剂、温和去垢剂如Triton X-100以释放膜结合酶)。离心条件需优化以获得澄清上清液。样本应分装保存于-80°C,避免反复冻融。
- 试剂稳定性: 草酰乙酸(OAA)和乙酰辅酶A(Acetyl-CoA)极不稳定。OAA需严格避光冷藏,最好新鲜配制。Acetyl-CoA溶解后应置于冰上,尽快使用。DTNB溶液也建议新鲜配制或避光保存。
- 反应线性: 必须确保测量的ΔA/min处于线性范围内(ΔA₄₁₂/min < 0.1)。如果反应速率过快,需稀释样本后重新测定。
- 温度控制: 严格控制反应温度对获得可重复结果至关重要。使用恒温比色皿架并充分预热。
- 精确操作: 加样(尤其是启动底物草酰乙酸时)要迅速准确,混匀要彻底但轻柔,避免产生气泡干扰吸光度读数。
- 空白对照: 务必设置合适的空白对照(样本空白),以扣除样本自身背景或试剂缓慢反应引起的吸光变化。
- 光程确认: 确保使用光程准确的比色皿。
- 安全: DTNB有一定毒性,操作时需佩戴手套,避免皮肤接触和吸入粉尘。
八、 方法应用与意义
通过精确测定柠檬酸合酶的活性,研究者能够:
- 评估线粒体功能: CS活性被广泛认为是线粒体含量和完整性的生物标志物,反映细胞有氧代谢能力。
- 研究代谢性疾病: 在肥胖、糖尿病、心血管疾病、神经退行性疾病(如阿尔茨海默病、帕金森病)等研究中,检测特定组织(如肌肉、脑、肝)的CS活性有助于阐明疾病的代谢紊乱机制。
- 细胞活力与增殖研究: 增殖旺盛的细胞通常具有更高的CS活性,反映其对能量的需求。
- 环境毒理学与药物筛选: 评估污染物或药物对生物体能量代谢的影响。
- 基础生物化学研究: 酶学性质(动力学参数、抑制剂研究)、代谢途径调控研究。
九、 总结
本方法建立在可靠的分光光度法原理基础上,通过监测DTNB与柠檬酸合酶反应生成的CoA-SH形成的黄色产物TNB²⁻在412 nm处的吸光变化,实现了对柠檬酸合酶活性的灵敏、定量检测。严格遵守操作规范,特别是注意试剂稳定性、温度控制、线性范围验证和正确设置对照,是获得准确、可靠结果的关键。该方法是研究细胞能量代谢状态和线粒体功能的不可或缺的工具。