柠檬酸合酶(CS)活性检测

发布时间：2025-06-27 15:35:42 阅读量：3 作者：生物检测中心

柠檬酸合酶(CS)活性检测方法

一、 引言
柠檬酸合酶（Citrate Synthase, CS，EC 4.1.3.7）是三羧酸循环（TCA循环或Krebs循环）中的第一个限速酶，催化草酰乙酸（Oxaloacetate）与乙酰辅酶A（Acetyl-CoA）缩合生成柠檬酸（Citrate）和辅酶A（CoA-SH）。其活性是评估细胞线粒体功能、代谢状态（尤其是有氧氧化能力）以及细胞活力和增殖状态的关键指标，在生物能量代谢、病理生理研究（如神经退行性疾病、肌肉疾病、癌症等）中具有重要意义。本研究采用基于分光光度法的标准检测方案。

二、 实验原理
本方法利用柠檬酸合酶催化的反应及其偶联反应进行检测：

  1. 主反应：
  
 
 
 
草酰乙酸 + 乙酰辅酶A + H₂O --> 柠檬酸 + 辅酶A(CoA-SH)
  1. 偶联显色反应： 利用5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)（DTNB）与反应生成的辅酶A（CoA-SH）迅速反应，生成黄色的5-硫代-2-硝基苯甲酸阴离子（TNB²⁻）。
  
 
 
 
CoA-SH + DTNB --> CoA-SS-TNB + TNB²⁻ (黄色)
  1. 检测原理： TNB²⁻在波长412 nm处具有强吸收峰。通过连续监测412 nm波长下吸光度（A₄₁₂）随时间上升的速率（ΔA₄₁₂/min），该速率与反应中产生的CoA-SH量成正比，进而与柠檬酸合酶的催化活性成正比。
 

三、 主要试剂与材料

  • 缓冲液： Tris-HCl缓冲液（100 mM, pH 8.0，含0.1% Triton X-100）。或根据样本类型优化的其他缓冲液（如含EDTA等）。
  • 底物溶液：
    • 草酰乙酸（Oxaloacetate, OAA）：临用前配制，浓度一般为0.5-1.0 mM（溶于上述缓冲液或水中）。注意：OAA在水溶液中不稳定，需冷藏避光，尽快使用。
    • 乙酰辅酶A（Acetyl-CoA）：临用前配制，浓度一般为0.2-0.3 mM（溶于冰水中）。冷冻储存，避免反复冻融。
  • 显色剂： 5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)（DTNB）：浓度一般为0.1-0.2 mM（溶于上述缓冲液或专用配制液）。
  • 标准品（可选）： 辅酶A（CoA-SH）标准溶液，用于制作标准曲线或验证反应效率。
  • 待测样本： 组织匀浆液（需用适当缓冲液匀浆并离心取上清）、细胞裂解液（需优化裂解条件）、纯化的酶溶液或线粒体提取物等。样本需保持低温（冰浴），避免反复冻融。
  • 其他： 双蒸水（ddH₂O）。
 

四、 仪器设备

  • 紫外-可见分光光度计（具备恒温比色皿架）
  • 恒温水浴锅
  • 微量移液器及配套枪头
  • 石英或玻璃比色皿（光程通常为1 cm）
  • 离心机（用于样本前处理）
  • 涡旋振荡器
  • 计时器
  • 冰盒
 

五、 操作步骤（以96孔板或1 mL体系为例）

  1. 预热： 开启分光光度计，设定温度至30°C（或文献/实验要求温度，常用25-37°C），预热恒温装置。将所需试剂（除底物和样本外）平衡至检测温度。
  2. 反应体系配制（终体积1 mL）：
    • 在一个干净的比色皿中依次加入：
      • 缓冲液： 940 μL
      • DTNB溶液（0.2 mM）： 50 μL （终浓度约0.01 mM）
      • 乙酰辅酶A溶液（0.3 mM）： 10 μL （终浓度约3 μM）
    • 轻柔混匀。
  3. 基线测定： 将比色皿放入已恒温的分光光度计中，在412 nm波长下读取吸光度（A₄₁₂），稳定1-2分钟，直至读数稳定。记录此值为基线值（通常接近0）。
  4. 启动反应：
    • 快速加入： 吸取适量待测样本（通常为5-20 μL组织/细胞裂解上清液，需根据酶活预实验调整体积，确保反应速率在线性范围内）加入比色皿。
    • 立即混匀： 迅速用移液器吹打混匀数次或加盖后轻微颠倒混匀（避免产生气泡）。
    • 开始监测： 立即开始计时并连续监测412 nm吸光度（A₄₁₂）的变化，至少持续2-5分钟（或直到获得足够线性部分的数据点）。设定仪器记录间隔为10-60秒。
    • 加入启动剂： (关键步骤) 在反应混合液预孵育1分钟后（使反应体系达到温度平衡并建立稳定的较低速率基线），加入草酰乙酸溶液（0.5 mM）10 μL（终浓度5 μM），迅速混匀。这是反应启动的标志性步骤。
  5. 对照组设置：
    • 样本空白： 用等体积的缓冲液代替样本加入反应体系。
    • 试剂空白（可选）： 用等体积的缓冲液代替样本和底物（草酰乙酸）加入反应体系。
    • 无乙酰辅酶A对照（可选，用于验证乙酰辅酶A依赖性）： 用缓冲液代替乙酰辅酶A溶液。
 

六、 数据处理与计算

  1. 绘制反应曲线： 以时间（min）为横坐标，A₄₁₂为纵坐标绘制反应进程曲线。
  2. 确定反应速率： 选择反应开始后OD值线性上升的一段（通常为加入草酰乙酸后30秒至2分钟之间），计算该时间段内每分钟吸光度的变化值（ΔA₄₁₂/min）。样本的ΔA₄₁₂/min需减去对应对照组（通常是样本空白）的ΔA₄₁₂/min值，得到校正后的反应速率ΔA/min。
  3. 计算酶活性：
    • 摩尔消光系数法： TNB²⁻在412 nm处的摩尔消光系数（ε₄₁₂）为13,600 M⁻¹cm⁻¹。
    • 酶活性定义： 一个柠檬酸合酶活力单位（U）是指在特定测定条件下（温度、pH），每分钟催化生成1 μmol CoA-SH（即1 μmol TNB²⁻）所需的酶量。
    • 计算公式：
  
 
 
 
酶活性 (U/mL) = (ΔA/min * Vt * Dil) / (ε * d * Vs) 酶活性 (U/mg蛋白) = [酶活性 (U/mL)] / [样本蛋白浓度 (mg/mL)]
 
 
 
* ΔA/min： 校正后的每分钟吸光度变化值 (ΔA₄₁₂/min) * Vt： 反应体系总体积 (mL)，例如 1.0 mL * Dil： 样本在检测体系中的稀释倍数（若样本直接加入未稀释，则为1；若为稀释后加入，需计算稀释因子） * ε： TNB²⁻的摩尔消光系数 (13,600 M⁻¹cm⁻¹ = 13,600 L mol⁻¹ cm⁻¹) * d： 比色皿光程 (cm)，通常为1 cm * Vs： 加入反应体系中的样本体积 (mL)，例如 0.01 mL (10 μL) * **样本蛋白浓度：** 需使用标准方法（如BCA法、Bradford法）单独测定，单位为 mg/mL。

七、 注意事项

  1. 样本制备： 匀浆/裂解过程需温和、快速、持续低温（冰浴），使用适当的缓冲液（常含蛋白酶抑制剂、温和去垢剂如Triton X-100以释放膜结合酶）。离心条件需优化以获得澄清上清液。样本应分装保存于-80°C，避免反复冻融。
  2. 试剂稳定性： 草酰乙酸（OAA）和乙酰辅酶A（Acetyl-CoA）极不稳定。OAA需严格避光冷藏，最好新鲜配制。Acetyl-CoA溶解后应置于冰上，尽快使用。DTNB溶液也建议新鲜配制或避光保存。
  3. 反应线性： 必须确保测量的ΔA/min处于线性范围内（ΔA₄₁₂/min < 0.1）。如果反应速率过快，需稀释样本后重新测定。
  4. 温度控制： 严格控制反应温度对获得可重复结果至关重要。使用恒温比色皿架并充分预热。
  5. 精确操作： 加样（尤其是启动底物草酰乙酸时）要迅速准确，混匀要彻底但轻柔，避免产生气泡干扰吸光度读数。
  6. 空白对照： 务必设置合适的空白对照（样本空白），以扣除样本自身背景或试剂缓慢反应引起的吸光变化。
  7. 光程确认： 确保使用光程准确的比色皿。
  8. 安全： DTNB有一定毒性，操作时需佩戴手套，避免皮肤接触和吸入粉尘。
 

八、 方法应用与意义
通过精确测定柠檬酸合酶的活性，研究者能够：

  1. 评估线粒体功能： CS活性被广泛认为是线粒体含量和完整性的生物标志物，反映细胞有氧代谢能力。
  2. 研究代谢性疾病： 在肥胖、糖尿病、心血管疾病、神经退行性疾病（如阿尔茨海默病、帕金森病）等研究中，检测特定组织（如肌肉、脑、肝）的CS活性有助于阐明疾病的代谢紊乱机制。
  3. 细胞活力与增殖研究： 增殖旺盛的细胞通常具有更高的CS活性，反映其对能量的需求。
  4. 环境毒理学与药物筛选： 评估污染物或药物对生物体能量代谢的影响。
  5. 基础生物化学研究： 酶学性质（动力学参数、抑制剂研究）、代谢途径调控研究。
 

九、 总结
本方法建立在可靠的分光光度法原理基础上，通过监测DTNB与柠檬酸合酶反应生成的CoA-SH形成的黄色产物TNB²⁻在412 nm处的吸光变化，实现了对柠檬酸合酶活性的灵敏、定量检测。严格遵守操作规范，特别是注意试剂稳定性、温度控制、线性范围验证和正确设置对照，是获得准确、可靠结果的关键。该方法是研究细胞能量代谢状态和线粒体功能的不可或缺的工具。