硫氧还蛋白氧化还原酶(TrxR)活性检测

发布时间:2025-06-27 15:31:19 阅读量:4 作者:生物检测中心

硫氧还蛋白氧化还原酶(TrxR)活性检测方法详解

一、 引言
硫氧还蛋白氧化还原酶(Thioredoxin Reductase, TrxR)是硫氧还蛋白系统核心酶,利用NADPH还原硫氧还蛋白(Trx),调控细胞氧化还原平衡、DNA合成、抗氧化防御及信号转导。准确检测TrxR活性对研究氧化应激、癌症、衰老等生理病理过程至关重要。本文介绍三种常用检测方法。

二、 检测原理

  1. NADPH消耗法: 基于TrxR催化反应消耗NADPH(于340nm有特征吸收),单位时间内吸光度下降速率反映酶活性。
  2. DTNB还原法(最常用): TrxR可直接还原5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)生成黄色产物5-硫代-2-硝基苯甲酸(TNB),于412nm监测吸光度上升速率。
  3. 胰岛素还原法: TrxR通过还原Trx,再由还原态Trx还原胰岛素二硫键。反应终止后,加入显色剂(如DTNB)测定还原型巯基生成量。
 

三、 DTNB还原法(推荐流程)

  • 原理: TrxR + NADPH + H⁺ → Reduced TrxR + NADP⁺Reduced TrxR + DTNB → Oxidized TrxR + TNB⁻ (黄色)
  • 优点: 简便、快速、灵敏、成本低。
  • 缺点: DTNB也可能被样品中其他还原酶或小分子还原物还原。
 

试剂:

  • 反应缓冲液(避光冷藏):
    • 100 mM 磷酸钾缓冲液 (KPi, pH 7.0)
    • 10 mM EDTA (螯合金属离子)
    • 1 mM DTNB (底物)
  • 启动液: 200 µM NADPH (溶于反应缓冲液,临用前配制)
  • 抑制剂对照液(可选): 反应缓冲液中加入 TrxR 特异性抑制剂(如 0.5-2.0 µM 金诺芬/Auranofin)
  • 样品: 含 TrxR 的样本(组织匀浆上清、细胞裂解液、纯酶液等),需预先测定总蛋白浓度。
 

仪器:

  • 紫外-可见分光光度计(具恒温功能)
  • 恒温水浴锅(或比色皿恒温控制器)
  • 微量移液器及匹配枪头
  • 石英/塑料比色皿(1 cm光径)
  • 计时器
  • 离心机
 

步骤:

  1. 样本准备: 样本置于冰上。若为组织或细胞,按标准方法裂解、离心取上清液,测定蛋白浓度(如BCA法)。
  2. 体系配置(示例体积):
    • 测试组: 向比色皿中加入 800 µL 反应缓冲液(含DTNB),预温至反应温度(通常25°C或37°C)。
    • 空白组: 800 µL 反应缓冲液(含DTNB)。
    • 抑制剂对照组(可选): 800 µL 抑制剂对照液(含DTNB)。
  3. 基线校准: 加入 100 µL 超纯水至空白组比色皿,混匀后放入分光光度计,412 nm波长下调零。
  4. 启动反应:
    • 向测试组比色皿中加入适量样本(如50-100 µL,根据预实验确定线性范围,蛋白量通常5-50 µg)。
    • 迅速加入 100 µL 启动液(含NADPH),立即轻柔颠倒混匀(避免气泡)。
    • 立即放入已调零的分光光度计中。
  5. 动力学监测:
    • 在412 nm波长下,连续监测吸光度(A412)变化至少2-3分钟(间隔5-15秒记录一次)。
    • 确保反应处于线性期(吸光度随时间稳定上升)。
  6. 抑制剂对照(可选): 将适量样本加入抑制剂对照组比色皿,后续操作同测试组(加入启动液后监测)。用于扣除DTNB的非特异性还原背景。
  7. 终止: 通常无需额外终止,监测足够时间即可。
 

数据处理:

  1. 计算反应速率:
    • 选择线性最佳部分的时间段(如30秒至150秒)。
    • 计算吸光度变化斜率 (ΔA412/min):斜率 = (A412_t2 - A412_t1) / (t2 - t1)
  2. 扣除背景:
    • 若有抑制剂对照组:校正斜率 = 测试组斜率 - 抑制剂对照组斜率
    • 若无抑制剂对照组:校正斜率 = 测试组斜率 - 空白组斜率(空白组为仅不加样本,通常背景很低)
  3. 计算酶活性:
    • 摩尔消光系数法: TNB在412nm的摩尔消光系数(ε)为13,600 M⁻¹cm⁻¹。
    • 酶活性定义: 通常定义为每分钟催化还原1 µmol DTNB所需的酶量(即国际单位,U)。考虑比色皿光径(L, cm)和反应体系体积(V, mL)。
    • 活性计算:
      TrxR活性 (U/mL) = [校正斜率 (ΔA412/min) × V (mL)] / [ε (M⁻¹cm⁻¹) × L (cm) × 样品体积(mL)]
      TrxR活性 (U/mg prot) = [TrxR活性 (U/mL)] / [样品蛋白浓度 (mg/mL)]
    • 注释:
      • V:最终反应体系总体积(如950 µL = 0.95 mL)
      • L:比色皿光径(通常1 cm)
      • 样品体积:加入到反应体系中的样本体积(如0.05 mL)
 

四、 其他方法简述

  • NADPH消耗法:
    • 原理: 监测340nm处NADPH吸光度下降速率。
    • 优点: 直接反映TrxR催化循环第一步。
    • 缺点: 灵敏度稍低于DTNB法;背景信号(NADPH自发氧化、其他氧化酶干扰)需仔细扣除。
  • 胰岛素还原法:
    • 原理: TrxR (NADPH) → Reduced Trx → Reduced Insulin (暴露-SH). 加DTNB显色测TNB。
    • 优点: 特异性较高(依赖Trx传递)。
    • 缺点: 步骤繁琐(需两步反应和终止),耗时长,灵敏度一般。
 

五、 关键注意事项

  1. 样本处理: 保持低温操作防止酶失活。避免反复冻融。去除样本中NADPH/NADP⁺(透析/脱盐柱)。
  2. 抑制剂对照: 强烈推荐使用金诺芬等特异性抑制剂区分TrxR特异性和非特异性还原活性。
  3. 线性范围: 确保吸光度变化在仪器线性响应范围内,酶量/蛋白量在反应速率与酶量呈线性的区间(需预实验确定)。
  4. 温度控制: 比色皿恒温至关重要,温度波动显著影响酶活。
  5. 试剂纯度与稳定性: NADPH水溶液极不稳定,必须临用前配制。DTNB溶液避光保存。
  6. 干扰物质: 样本中高浓度还原剂(如GSH、DTT)会直接还原DTNB,干扰测定。需评估或去除。
  7. 安全: DTNB粉末有刺激性,操作时佩戴口罩手套。碘乙酰胺(有时用于终止胰岛素法)是强效致癌物,需极其谨慎。
 

六、 应用意义
通过准确测定TrxR活性,可评估:

  • 不同生理/病理状态下(氧化应激、炎症、肿瘤)细胞或组织的还原能力变化。
  • 药物、毒素、营养素等对硫氧还蛋白系统的影响。
  • 基因敲除/过表达模型中TrxR的功能研究。
  • 疾病诊断及治疗靶点研究的潜在生物标志物。
 

七、 结果示例(仅供参考)
“采用DTNB还原法测定大鼠肝组织匀浆上清液中TrxR活性。反应体系含...。检测结果显示,正常组肝组织TrxR活性为25.3 ± 3.7 U/mg protein;经氧化应激诱导后,实验组活性显著升高至38.6 ± 4.2 U/mg protein (p<0.01),表明该模型下肝脏TrxR系统被激活以应对氧化损伤。”

八、 总结
DTNB还原法是检测TrxR活性的优选方法,兼具灵敏度和便捷性。严格遵守操作规程(特别是抑制剂对照、温度控制、线性验证)对获得可靠数据至关重要。研究者可根据样本特性及实验目的选择最合适的检测策略。


本文提供的方法步骤及注意事项均基于通用生物化学原理,可安全用于非商业目的的科学研究和教学实践。