硫氧还蛋白氧化还原酶(TrxR)活性检测

发布时间：2025-06-27 15:31:19 阅读量：4 作者：生物检测中心

硫氧还蛋白氧化还原酶(TrxR)活性检测方法详解

一、 引言
硫氧还蛋白氧化还原酶（Thioredoxin Reductase, TrxR）是硫氧还蛋白系统核心酶，利用NADPH还原硫氧还蛋白（Trx），调控细胞氧化还原平衡、DNA合成、抗氧化防御及信号转导。准确检测TrxR活性对研究氧化应激、癌症、衰老等生理病理过程至关重要。本文介绍三种常用检测方法。

二、 检测原理

  1. NADPH消耗法： 基于TrxR催化反应消耗NADPH（于340nm有特征吸收），单位时间内吸光度下降速率反映酶活性。
  2. DTNB还原法（最常用）： TrxR可直接还原5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)（DTNB）生成黄色产物5-硫代-2-硝基苯甲酸（TNB），于412nm监测吸光度上升速率。
  3. 胰岛素还原法： TrxR通过还原Trx，再由还原态Trx还原胰岛素二硫键。反应终止后，加入显色剂（如DTNB）测定还原型巯基生成量。
 

三、 DTNB还原法（推荐流程）

  • 原理： TrxR + NADPH + H⁺ → Reduced TrxR + NADP⁺；Reduced TrxR + DTNB → Oxidized TrxR + TNB⁻ (黄色)
  • 优点： 简便、快速、灵敏、成本低。
  • 缺点： DTNB也可能被样品中其他还原酶或小分子还原物还原。
 

试剂：

  • 反应缓冲液（避光冷藏）：
    • 100 mM 磷酸钾缓冲液 (KPi, pH 7.0)
    • 10 mM EDTA (螯合金属离子)
    • 1 mM DTNB (底物)
  • 启动液： 200 µM NADPH (溶于反应缓冲液，临用前配制)
  • 抑制剂对照液（可选）： 反应缓冲液中加入 TrxR 特异性抑制剂（如 0.5-2.0 µM 金诺芬/Auranofin）
  • 样品： 含 TrxR 的样本（组织匀浆上清、细胞裂解液、纯酶液等），需预先测定总蛋白浓度。
 

仪器：

  • 紫外-可见分光光度计（具恒温功能）
  • 恒温水浴锅（或比色皿恒温控制器）
  • 微量移液器及匹配枪头
  • 石英/塑料比色皿（1 cm光径）
  • 计时器
  • 离心机
 

步骤：

  1. 样本准备： 样本置于冰上。若为组织或细胞，按标准方法裂解、离心取上清液，测定蛋白浓度（如BCA法）。
  2. 体系配置（示例体积）：
    • 测试组： 向比色皿中加入 800 µL 反应缓冲液（含DTNB），预温至反应温度（通常25°C或37°C）。
    • 空白组： 800 µL 反应缓冲液（含DTNB）。
    • 抑制剂对照组（可选）： 800 µL 抑制剂对照液（含DTNB）。
  3. 基线校准： 加入 100 µL 超纯水至空白组比色皿，混匀后放入分光光度计，412 nm波长下调零。
  4. 启动反应：
    • 向测试组比色皿中加入适量样本（如50-100 µL，根据预实验确定线性范围，蛋白量通常5-50 µg）。
    • 迅速加入 100 µL 启动液（含NADPH），立即轻柔颠倒混匀（避免气泡）。
    • 立即放入已调零的分光光度计中。
  5. 动力学监测：
    • 在412 nm波长下，连续监测吸光度(A412)变化至少2-3分钟（间隔5-15秒记录一次）。
    • 确保反应处于线性期（吸光度随时间稳定上升）。
  6. 抑制剂对照（可选）： 将适量样本加入抑制剂对照组比色皿，后续操作同测试组（加入启动液后监测）。用于扣除DTNB的非特异性还原背景。
  7. 终止： 通常无需额外终止，监测足够时间即可。
 

数据处理：

  1. 计算反应速率：
    • 选择线性最佳部分的时间段（如30秒至150秒）。
    • 计算吸光度变化斜率 (ΔA412/min)：斜率 = (A412_t2 - A412_t1) / (t2 - t1)
  2. 扣除背景：
    • 若有抑制剂对照组：校正斜率 = 测试组斜率 - 抑制剂对照组斜率
    • 若无抑制剂对照组：校正斜率 = 测试组斜率 - 空白组斜率（空白组为仅不加样本，通常背景很低）
  3. 计算酶活性：
    • 摩尔消光系数法： TNB在412nm的摩尔消光系数(ε)为13,600 M⁻¹cm⁻¹。
    • 酶活性定义： 通常定义为每分钟催化还原1 µmol DTNB所需的酶量（即国际单位，U）。考虑比色皿光径(L, cm)和反应体系体积(V, mL)。
    • 活性计算：
      TrxR活性 (U/mL) = [校正斜率 (ΔA412/min) × V (mL)] / [ε (M⁻¹cm⁻¹) × L (cm) × 样品体积(mL)]
      TrxR活性 (U/mg prot) = [TrxR活性 (U/mL)] / [样品蛋白浓度 (mg/mL)]
    • 注释：
      • V：最终反应体系总体积（如950 µL = 0.95 mL）
      • L：比色皿光径（通常1 cm）
      • 样品体积：加入到反应体系中的样本体积（如0.05 mL）
 

四、 其他方法简述

  • NADPH消耗法：
    • 原理： 监测340nm处NADPH吸光度下降速率。
    • 优点： 直接反映TrxR催化循环第一步。
    • 缺点： 灵敏度稍低于DTNB法；背景信号（NADPH自发氧化、其他氧化酶干扰）需仔细扣除。
  • 胰岛素还原法：
    • 原理： TrxR (NADPH) → Reduced Trx → Reduced Insulin (暴露-SH). 加DTNB显色测TNB。
    • 优点： 特异性较高（依赖Trx传递）。
    • 缺点： 步骤繁琐（需两步反应和终止），耗时长，灵敏度一般。
 

五、 关键注意事项

  1. 样本处理： 保持低温操作防止酶失活。避免反复冻融。去除样本中NADPH/NADP⁺（透析/脱盐柱）。
  2. 抑制剂对照： 强烈推荐使用金诺芬等特异性抑制剂区分TrxR特异性和非特异性还原活性。
  3. 线性范围： 确保吸光度变化在仪器线性响应范围内，酶量/蛋白量在反应速率与酶量呈线性的区间（需预实验确定）。
  4. 温度控制： 比色皿恒温至关重要，温度波动显著影响酶活。
  5. 试剂纯度与稳定性： NADPH水溶液极不稳定，必须临用前配制。DTNB溶液避光保存。
  6. 干扰物质： 样本中高浓度还原剂（如GSH、DTT）会直接还原DTNB，干扰测定。需评估或去除。
  7. 安全： DTNB粉末有刺激性，操作时佩戴口罩手套。碘乙酰胺（有时用于终止胰岛素法）是强效致癌物，需极其谨慎。
 

六、 应用意义
通过准确测定TrxR活性，可评估：

  • 不同生理/病理状态下（氧化应激、炎症、肿瘤）细胞或组织的还原能力变化。
  • 药物、毒素、营养素等对硫氧还蛋白系统的影响。
  • 基因敲除/过表达模型中TrxR的功能研究。
  • 疾病诊断及治疗靶点研究的潜在生物标志物。
 

七、 结果示例（仅供参考）
“采用DTNB还原法测定大鼠肝组织匀浆上清液中TrxR活性。反应体系含...。检测结果显示，正常组肝组织TrxR活性为25.3 ± 3.7 U/mg protein；经氧化应激诱导后，实验组活性显著升高至38.6 ± 4.2 U/mg protein (p<0.01)，表明该模型下肝脏TrxR系统被激活以应对氧化损伤。”

八、 总结
DTNB还原法是检测TrxR活性的优选方法，兼具灵敏度和便捷性。严格遵守操作规程（特别是抑制剂对照、温度控制、线性验证）对获得可靠数据至关重要。研究者可根据样本特性及实验目的选择最合适的检测策略。

本文提供的方法步骤及注意事项均基于通用生物化学原理，可安全用于非商业目的的科学研究和教学实践。