可溶性淀粉合成酶(SSS)活性检测 - 中析研究所生物检测中心

可溶性淀粉合成酶(SSS)活性检测方法

一、引言
可溶性淀粉合成酶(SSS, EC 2.4.1.21)是植物淀粉生物合成的关键酶，催化葡萄糖基从尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)转移到葡聚糖引物(如支链淀粉)的非还原端，主要负责淀粉链的延伸。精确检测SSS活性对于研究植物生长发育、作物品质改良及淀粉代谢调控机制至关重要。本方法描述了基于酶偶联反应的SSS活性测定方案。

二、检测原理
SSS催化如下反应：
UDPG + (葡聚糖)n → UDP + (葡聚糖)n+1

反应生成的UDP在丙酮酸激酶(PK)和乳酸脱氢酶(LDH)偶联作用下，转化为乳酸，同时伴随还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)氧化为NAD+：

UDP + 磷酸烯醇式丙酮酸(PEP) → 丙酮酸 + UTP (PK催化)
丙酮酸 + NADH + H+ → 乳酸 + NAD+ (LDH催化)

通过监测340 nm波长处NADH吸光度的下降速率（ΔA340/min），可间接反映SSS催化UDPG消耗的速率，从而计算酶活性。

三、试剂与溶液

提取缓冲液： 50 mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)-氢氧化钠缓冲液(pH 7.5)，含5 mmol/L 二硫苏糖醇(DTT)、2 mmol/L 乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)、10% (v/v) 甘油、0.1% (v/v) 聚氧乙烯辛基苯基醚(Triton X-100)、1 mmol/L 苯甲基磺酰氟(PMSF)。预冷至4°C。
反应缓冲液： 50 mmol/L HEPES-氢氧化钠缓冲液(pH 7.5)，含1 mmol/L EDTA-Na2、5 mmol/L 醋酸镁。
引物溶液： 2% (w/v) 支链淀粉溶解于反应缓冲液。
尿苷二磷酸葡萄糖溶液： 20 mmol/L UDPG溶解于超纯水。-20°C保存。
磷酸烯醇式丙酮酸溶液： 100 mmol/L PEP溶解于超纯水。-20°C保存。
NADH溶液： 10 mmol/L NADH溶解于超纯水。现配现用，避光。
丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶溶液： 含丙酮酸激酶(PK)与乳酸脱氢酶(LDH)的混合酶液（按产品说明书推荐浓度稀释于反应缓冲液）。
磷酸钾缓冲液(终止液)： 0.5 mol/L 磷酸氢二钾溶液(pH 10.4)。
碘试剂： 含0.02% (w/v) 碘与0.2% (w/v) 碘化钾的溶液。棕色瓶避光保存。

四、仪器设备

高速冷冻离心机
分光光度计（配备恒温比色皿架）
恒温水浴锅
低温研磨仪或研钵（预冷）
移液器及配套无菌吸头
1.5 mL 离心管（预冷）
冰盒
比色皿（光径1 cm）

五、实验步骤
(一) 酶液制备

取新鲜植物组织（如叶片、种子胚乳）约0.5 g，液氮速冻后于预冷研钵中充分研磨成细粉。
转移粉末至预冷离心管，加入1 mL冰预冷提取缓冲液，涡旋混匀。
4°C，15,000 ×g 离心15分钟。
小心吸取上清液（粗酶提取物），转移至新预冷离心管，置于冰上备用（此为待测酶液）。

(二) 活性测定（偶联法）

将分光光度计比色室温度设定为30°C（或所需反应温度）。
在比色皿中依次加入以下试剂（总体积1 mL）：
- 反应缓冲液：700 µL
- 引物溶液（2%支链淀粉）：100 µL
- 磷酸烯醇式丙酮酸溶液（100 mmol/L）：20 µL
- 丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶溶液：10 µL
- NADH溶液（10 mmol/L）：50 µL
- 待测酶液：100 µL (需做空白对照，用等体积提取缓冲液代替)
温和混匀，30°C孵育5分钟，使体系平衡。
加入20 µL UDPG溶液（20 mmol/L）启动反应，立即混匀。
迅速将比色皿放入分光光度计，于340 nm波长下连续监测吸光度变化（ΔA340/min），记录起始2-4分钟内线性较好的下降速率（通常ΔA340/min在0.01-0.05之间为宜）。

(三) 空白对照
以等体积的提取缓冲液代替待测酶液，其余步骤与样品测定完全相同。

六、数据分析

计算酶促反应速率：
- 样品反应速率 (V_sample) = - (ΔA340/min_sample - ΔA340/min_blank)
- (负号表示吸光度下降，取绝对值表示速率)
计算SSS酶活性：
- SSS活性 (U/g FW 或 U/mg prot) = [V_sample × V_total × df] / [ε × d × V_enzyme × FW 或 Prot]
- 式中：
  - V_sample：酶促反应速率（ΔA340/min）
  - V_total：反应体系总体积（L，本方案为1 mL = 0.001 L）
  - df：酶液制备过程中的稀释倍数（若未稀释则为1）
  - ε：NADH在340 nm处的摩尔消光系数（6.22 × 10^3 L·mol⁻¹·cm⁻¹）
  - d：比色皿光径（cm，通常为1 cm）
  - V_enzyme：反应体系中加入的粗酶液体积（L，本方案为100 µL = 0.0001 L）
  - FW：样品鲜重（g）
  - Prot：反应体系中粗酶液的蛋白质含量（mg）（若以蛋白浓度表示活性，需额外测定酶液蛋白浓度，常用方法如Bradford法）。
- 单位定义(U)： 在上述反应条件下，每分钟催化生成1 µmol NAD⁺所需的酶量（对应于消耗1 µmol UDPG）。

七、注意事项

样品新鲜度与低温操作： 植物组织需新鲜或液氮速冻保存。所有提取和配制过程需在冰上进行，防止酶失活。
酶液稳定性： 粗酶液中SSS活性通常不稳定，建议在提取后4°C保存并于2-4小时内测定。
线性范围： 确保监测的吸光度下降速率在线性范围内（R² > 0.99）。若速率过快，需适当稀释酶液后重新测定。
试剂稳定性： NADH溶液对光敏感，需避光保存并现配现用。PEP、UDPG溶液-20°C保存，避免反复冻融。
引物选择： 支链淀粉是常用引物，其浓度和质量会影响反应速率。
抑制剂/激活剂： 提取缓冲液中EDTA螯合金属离子，DTT和甘油保护酶活性。
背景干扰： 确保反应启动前基线稳定，空白对照需准确扣除内源性消耗UDPG或NADH的干扰。
pH与温度： 严格控制反应体系的pH和温度，其对酶活影响显著。
离心参数： 离心去除组织碎片对于获得澄清上清液至关重要。

八、应用与意义
本方法广泛应用于：

研究不同植物品种、组织器官、发育阶段SSS活性的差异。
分析环境因子（光照、温度、水分、营养胁迫）对淀粉合成的影响。
评估基因工程（过表达/敲除SSS基因）对淀粉代谢途径的修饰效果。
筛选高淀粉含量或特定淀粉结构（直链/支链淀粉比例）的作物种质资源。

九、替代方法简述

放射性标记法： 使用¹⁴C-UDPG作为底物，反应后通过沉淀或层析分离放射性标记的淀粉，测定放射强度。灵敏度高但涉及放射性物质，操作复杂且受限。
碘染色法： 基于SSS催化合成的淀粉与碘形成蓝色复合物，测定620 nm吸光度。操作简便但特异性相对较低，易受其他淀粉代谢酶干扰（需严格控制反应条件）。
ADP-Glucose法： 若SSS能利用ADPG作为底物（部分来源SSS有此特性），可采用类似偶联系统检测ADP生成。