可溶性淀粉合成酶(SSS)活性检测方法
一、引言
可溶性淀粉合成酶(SSS, EC 2.4.1.21)是植物淀粉生物合成的关键酶,催化葡萄糖基从尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)转移到葡聚糖引物(如支链淀粉)的非还原端,主要负责淀粉链的延伸。精确检测SSS活性对于研究植物生长发育、作物品质改良及淀粉代谢调控机制至关重要。本方法描述了基于酶偶联反应的SSS活性测定方案。
二、检测原理
SSS催化如下反应:
UDPG + (葡聚糖)n → UDP + (葡聚糖)n+1
反应生成的UDP在丙酮酸激酶(PK)和乳酸脱氢酶(LDH)偶联作用下,转化为乳酸,同时伴随还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)氧化为NAD+:
- UDP + 磷酸烯醇式丙酮酸(PEP) → 丙酮酸 + UTP (PK催化)
- 丙酮酸 + NADH + H+ → 乳酸 + NAD+ (LDH催化)
通过监测340 nm波长处NADH吸光度的下降速率(ΔA340/min),可间接反映SSS催化UDPG消耗的速率,从而计算酶活性。
三、试剂与溶液
- 提取缓冲液: 50 mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)-氢氧化钠缓冲液(pH 7.5),含5 mmol/L 二硫苏糖醇(DTT)、2 mmol/L 乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)、10% (v/v) 甘油、0.1% (v/v) 聚氧乙烯辛基苯基醚(Triton X-100)、1 mmol/L 苯甲基磺酰氟(PMSF)。预冷至4°C。
- 反应缓冲液: 50 mmol/L HEPES-氢氧化钠缓冲液(pH 7.5),含1 mmol/L EDTA-Na2、5 mmol/L 醋酸镁。
- 引物溶液: 2% (w/v) 支链淀粉溶解于反应缓冲液。
- 尿苷二磷酸葡萄糖溶液: 20 mmol/L UDPG溶解于超纯水。-20°C保存。
- 磷酸烯醇式丙酮酸溶液: 100 mmol/L PEP溶解于超纯水。-20°C保存。
- NADH溶液: 10 mmol/L NADH溶解于超纯水。现配现用,避光。
- 丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶溶液: 含丙酮酸激酶(PK)与乳酸脱氢酶(LDH)的混合酶液(按产品说明书推荐浓度稀释于反应缓冲液)。
- 磷酸钾缓冲液(终止液): 0.5 mol/L 磷酸氢二钾溶液(pH 10.4)。
- 碘试剂: 含0.02% (w/v) 碘与0.2% (w/v) 碘化钾的溶液。棕色瓶避光保存。
四、仪器设备
- 高速冷冻离心机
- 分光光度计(配备恒温比色皿架)
- 恒温水浴锅
- 低温研磨仪或研钵(预冷)
- 移液器及配套无菌吸头
- 1.5 mL 离心管(预冷)
- 冰盒
- 比色皿(光径1 cm)
五、实验步骤
(一) 酶液制备
- 取新鲜植物组织(如叶片、种子胚乳)约0.5 g,液氮速冻后于预冷研钵中充分研磨成细粉。
- 转移粉末至预冷离心管,加入1 mL冰预冷提取缓冲液,涡旋混匀。
- 4°C,15,000 ×g 离心15分钟。
- 小心吸取上清液(粗酶提取物),转移至新预冷离心管,置于冰上备用(此为待测酶液)。
(二) 活性测定(偶联法)
- 将分光光度计比色室温度设定为30°C(或所需反应温度)。
- 在比色皿中依次加入以下试剂(总体积1 mL):
- 反应缓冲液:700 µL
- 引物溶液(2%支链淀粉):100 µL
- 磷酸烯醇式丙酮酸溶液(100 mmol/L):20 µL
- 丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶溶液:10 µL
- NADH溶液(10 mmol/L):50 µL
- 待测酶液:100 µL (需做空白对照,用等体积提取缓冲液代替)
- 温和混匀,30°C孵育5分钟,使体系平衡。
- 加入20 µL UDPG溶液(20 mmol/L)启动反应,立即混匀。
- 迅速将比色皿放入分光光度计,于340 nm波长下连续监测吸光度变化(ΔA340/min),记录起始2-4分钟内线性较好的下降速率(通常ΔA340/min在0.01-0.05之间为宜)。
(三) 空白对照
以等体积的提取缓冲液代替待测酶液,其余步骤与样品测定完全相同。
六、数据分析
- 计算酶促反应速率:
- 样品反应速率 (V_sample) = - (ΔA340/min_sample - ΔA340/min_blank)
- (负号表示吸光度下降,取绝对值表示速率)
- 计算SSS酶活性:
- SSS活性 (U/g FW 或 U/mg prot) = [V_sample × V_total × df] / [ε × d × V_enzyme × FW 或 Prot]
- 式中:
V_sample
:酶促反应速率(ΔA340/min)V_total
:反应体系总体积(L,本方案为1 mL = 0.001 L)df
:酶液制备过程中的稀释倍数(若未稀释则为1)ε
:NADH在340 nm处的摩尔消光系数(6.22 × 10^3 L·mol⁻¹·cm⁻¹)d
:比色皿光径(cm,通常为1 cm)V_enzyme
:反应体系中加入的粗酶液体积(L,本方案为100 µL = 0.0001 L)FW
:样品鲜重(g)Prot
:反应体系中粗酶液的蛋白质含量(mg)(若以蛋白浓度表示活性,需额外测定酶液蛋白浓度,常用方法如Bradford法)。
- 单位定义(U): 在上述反应条件下,每分钟催化生成1 µmol NAD⁺所需的酶量(对应于消耗1 µmol UDPG)。
七、注意事项
- 样品新鲜度与低温操作: 植物组织需新鲜或液氮速冻保存。所有提取和配制过程需在冰上进行,防止酶失活。
- 酶液稳定性: 粗酶液中SSS活性通常不稳定,建议在提取后4°C保存并于2-4小时内测定。
- 线性范围: 确保监测的吸光度下降速率在线性范围内(R² > 0.99)。若速率过快,需适当稀释酶液后重新测定。
- 试剂稳定性: NADH溶液对光敏感,需避光保存并现配现用。PEP、UDPG溶液-20°C保存,避免反复冻融。
- 引物选择: 支链淀粉是常用引物,其浓度和质量会影响反应速率。
- 抑制剂/激活剂: 提取缓冲液中EDTA螯合金属离子,DTT和甘油保护酶活性。
- 背景干扰: 确保反应启动前基线稳定,空白对照需准确扣除内源性消耗UDPG或NADH的干扰。
- pH与温度: 严格控制反应体系的pH和温度,其对酶活影响显著。
- 离心参数: 离心去除组织碎片对于获得澄清上清液至关重要。
八、应用与意义
本方法广泛应用于:
- 研究不同植物品种、组织器官、发育阶段SSS活性的差异。
- 分析环境因子(光照、温度、水分、营养胁迫)对淀粉合成的影响。
- 评估基因工程(过表达/敲除SSS基因)对淀粉代谢途径的修饰效果。
- 筛选高淀粉含量或特定淀粉结构(直链/支链淀粉比例)的作物种质资源。
九、替代方法简述
- 放射性标记法: 使用¹⁴C-UDPG作为底物,反应后通过沉淀或层析分离放射性标记的淀粉,测定放射强度。灵敏度高但涉及放射性物质,操作复杂且受限。
- 碘染色法: 基于SSS催化合成的淀粉与碘形成蓝色复合物,测定620 nm吸光度。操作简便但特异性相对较低,易受其他淀粉代谢酶干扰(需严格控制反应条件)。
- ADP-Glucose法: 若SSS能利用ADPG作为底物(部分来源SSS有此特性),可采用类似偶联系统检测ADP生成。
本方法基于经典酶学检测原理,可在具备基本生化实验室条件的机构中进行,为深入研究淀粉生物合成机制提供了可靠的技术支持。