β-淀粉酶活性检测

发布时间:2025-06-27 15:09:04 阅读量:5 作者:生物检测中心

以下是关于β-淀粉酶活性检测的完整技术文档,内容严格遵循学术规范,不包含任何企业或品牌信息:


β-淀粉酶活性检测方法(还原糖测定法)

一、检测原理

β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)是一种外切糖苷酶,专一性水解淀粉非还原末端的α-1,4糖苷键,生成β-麦芽糖。其活性通过测定酶解产物还原糖(麦芽糖)的生成量进行定量。常用检测方法为3,5-二硝基水杨酸比色法(DNS法)伯川(Somogyi-Nelson)法


二、试剂与仪器

试剂(均为分析纯):

  1. 可溶性淀粉溶液(1%,w/v):准确称取1.00g可溶性淀粉,加少量蒸馏水调浆,沸水浴糊化后定容至100mL。
  2. 磷酸-柠檬酸缓冲液(pH 4.8,0.1M):
    • A液:0.1M柠檬酸(19.2g/L)
    • B液:0.2M磷酸氢二钠(28.4g/L Na₂HPO₄)
      取A液 55.5mL + B液 44.5mL,混合后调pH至4.8。
  3. DNS显色剂:
    3,5-二硝基水杨酸1.00g + 20mL 2M NaOH → 溶解后加30g酒石酸钾钠 → 定容至100mL(避光保存)。
  4. 麦芽糖标准溶液(1mg/mL):精确称取100mg麦芽糖,蒸馏水溶解定容至100mL。
 

仪器

  • 恒温水浴锅(±0.5℃)
  • 分光光度计
  • 离心机
  • 计时器
  • 移液器及玻璃器皿
 

三、标准曲线制作

  1. 取7支试管,按下表加入试剂:

    管号 麦芽糖标准液(mL) 蒸馏水(mL) 麦芽糖量(μg)
    0 0 1.0 0
    1 0.2 0.8 200
    2 0.4 0.6 400
    3 0.6 0.4 600
    4 0.8 0.2 800
    5 1.0 0 1000
  2. 各管加1.0mL DNS试剂,沸水浴5分钟,冷却后定容至10mL。

  3. 540nm测定吸光度(A₅₄₀),绘制标准曲线。

 

四、酶活性检测步骤

  1. 酶液制备
    样品(如麦芽粉)用缓冲液提取→离心(4000rpm,10min)→上清液为待测酶液。
  2. 酶解反应
    • 试管1(空白):1.0mL缓冲液 + 1.0mL淀粉溶液 → 沸水浴5分钟灭酶
    • 试管2(样品):1.0mL酶液 + 1.0mL淀粉溶液 → 立即混匀,37℃水浴精确反应10分钟 → 立即沸水浴5分钟终止反应
  3. 显色测定
    各管加1.0mL DNS试剂 → 沸水浴5分钟 → 冷却定容至10mL → 测定A₅₄₀。
 

五、活性计算

  1. 根据样品A₅₄₀值从标准曲线查得麦芽糖生成量(μg)。
  2. 酶活性定义:37℃、pH 4.8条件下,每分钟催化生成1μmol麦芽糖所需的酶量为1个活性单位(U)
    计算公式
    < data-sourcepos="null:null-null:null" xmlns="http://www.w3.org/1998/Math/MathML">酶活性(U/g)=(CC0)×Vt×Dt×M×342×103\text{酶活性} (U/g) = \frac{(C - C_0) \times V_t \times D}{t \times M \times 342} \times 10^3
    • < data-sourcepos="null:null-null:null" xmlns="http://www.w3.org/1998/Math/MathML">CC:样品麦芽糖量(μg)
    • < data-sourcepos="null:null-null:null" xmlns="http://www.w3.org/1998/Math/MathML">C0C_0:空白麦芽糖量(μg)
    • < data-sourcepos="null:null-null:null" xmlns="http://www.w3.org/1998/Math/MathML">VtV_t:体系总体积(mL)
    • < data-sourcepos="null:null-null:null" xmlns="http://www.w3.org/1998/Math/MathML">DD:酶液稀释倍数
    • < data-sourcepos="null:null-null:null" xmlns="http://www.w3.org/1998/Math/MathML">tt:反应时间(min)
    • < data-sourcepos="null:null-null:null" xmlns="http://www.w3.org/1998/Math/MathML">MM:样品质量(g)
    • 342:麦芽糖分子量
 

六、注意事项

  1. 淀粉溶液需现配现用,避免老化影响水解效率。
  2. 终止反应必须迅速,防止非酶促水解。
  3. 酶液浓度需调整至A₅₄₀在0.1-0.8(线性范围内)。
  4. 温度波动需≤±0.5℃,否则显著影响结果。
 

七、方法学验证

  • 精密度:平行3次测定RSD<5%
  • 准确度:加标回收率95-105%
  • 特异性:可通过碘液反应辅助验证(β-淀粉酶水解直链淀粉呈蓝色,水解支链淀粉呈红褐色)
 

八、应用场景

该检测法适用于:

  • 谷物(大麦、小麦)发芽品质评价
  • 淀粉糖化工艺优化
  • 食品加工用酶制剂质量控制
  • 植物生理学研究
 

参考文献
Bergmeyer, H.U. (1983). Methods of Enzymatic Analysis (3rd ed.). Academic Press.
International Union of Biochemistry (1992). Enzyme Nomenclature. Elsevier.


本方法符合ISO/GB标准要求,适用于实验室常规检测与科研分析,结果具有可靠性和重现性。