矮牵牛色素-3-O-葡萄糖苷检测 - 中析研究所生物检测中心

矮牵牛色素-3-O-葡萄糖苷检测方法与技术

矮牵牛色素-3-O-葡萄糖苷是矮牵牛花瓣中呈现丰富色彩的关键花色苷之一，对其进行准确检测在植物生理生化研究、花色育种及天然色素开发利用中具有重要意义。以下为完整的检测方法，严格遵循学术规范：

样品采集： 选取新鲜、健康的矮牵牛花瓣，迅速用液氮冷冻，-80°C保存备用。
提取溶剂： 酸性醇溶液（如含0.1% HCl的甲醇或乙醇）或酸化水溶液（如含2%甲酸的水）。酸性环境有助于稳定花色苷结构。
提取流程：
- 称取冷冻花瓣样品（约100-200 mg），液氮研磨成细粉。
- 加入预冷提取溶剂（如5-10 mL），涡旋混合。
- 超声辅助提取（冰浴，功率适中，如15-20 min）。
- 4°C下离心（如12,000 rpm, 15 min），收集上清液。
- 残渣重复提取1-2次，合并上清液。
浓缩与净化： 上清液可经减压浓缩或氮吹去除大部分溶剂。若杂质较多，可采用固相萃取柱（如C18柱）进行净化：活化→上样→水洗→酸性醇洗脱目标物→收集洗脱液→浓缩定容。过0.22 μm有机系滤膜待测。

此为目前最常用、最准确的定性定量方法。

色谱条件：
- 色谱柱： 反相C18色谱柱（规格如150 mm × 4.6 mm, 5 μm）。
- 流动相：
  - A相： 含适量酸（如0.1%甲酸、1-5%甲酸或1-5%乙酸）的水溶液。
  - B相： 含等量酸的乙腈或甲醇。
- 洗脱程序： 采用梯度洗脱（例：0 min: 5% B; 20 min: 25% B; 25 min: 95% B; 28 min: 95% B; 30 min: 5% B）。流速通常为0.8-1.0 mL/min。
- 柱温： 30-40°C。
- 检测波长： 二极管阵列检测器（DAD）在520-530 nm附近有特征吸收峰（可同时进行紫外-可见光谱扫描，辅助定性）。
- 进样量： 5-20 μL。
质谱条件：
- 离子源： 电喷雾离子源（ESI）。
- 离子模式： 正离子模式（花色苷在ESI+下易形成[M]+离子）。
- 监测方式：
  - 定性（Full Scan/MS²）： 扫描范围覆盖目标物分子量（约465 Da），对母离子进行二级质谱碎裂，获取特征碎片信息（如失去葡萄糖基m/z 303 [花翠素碎片离子]+，以及可能的酰基碎片）。
  - 定量（SRM/MRM）： 选择母离子m/z 465 → 子离子m/z 303等特异性离子对进行监测，提高选择性和灵敏度。
- 源参数： 根据具体仪器优化离子源温度、雾化气、干燥气流速、毛细管电压、碰撞能量等。

定性确认：
- 与标准品保留时间比对。
- 特征紫外-可见光谱（520-530 nm最大吸收，常带肩峰）比对。
- 分子离子峰（[M]+ m/z 465）确认。
- 特征二级质谱碎片（如m/z 303 [M-glucose]+）比对。
- 三者信息综合判断，确保特异性。
定量分析：
- 标准曲线法： 使用已知浓度的矮牵牛色素-3-O-葡萄糖苷标准品配制系列浓度溶液，按上述色谱质谱条件进样分析。以峰面积（或峰高）对浓度绘制标准曲线（通常要求线性良好，R² ≥ 0.99）。
- 样品测定： 在相同条件下分析样品，根据目标峰面积和标准曲线计算样品中目标物的含量（常用单位：μg/g 鲜重或干重）。