七叶苷检测 - 中析研究所生物检测中心

七叶苷检测：原理、方法与临床应用详解

七叶苷检测是细菌学检验中一项经典而重要的生化试验技术，主要用于鉴定某些细菌（特别是链球菌属、肠球菌属和相关细菌）分解七叶苷的能力。该检测操作简便，结果可靠，在微生物鉴定和分类中扮演着关键角色。

一、检测原理

七叶苷（Esculin，化学名称为6,7-二羟基香豆素-6-β-D-葡萄糖苷）是由葡萄糖苷与七叶苷原（6,7-二羟基香豆素）结合而成的一种糖苷化合物。检测的核心在于目标细菌是否产生一种特定的酶：β-葡萄糖苷酶。

酶水解反应： 若待测菌株能产生β-葡萄糖苷酶，该酶可特异性水解七叶苷分子中的葡萄糖苷键。
产物生成： 水解后产生葡萄糖和七叶苷原（Esculetin）。
显色反应（关键步骤）：
- 七叶苷原与铁离子的螯合： 在培养基或反应体系中加入含有柠檬酸铁铵或氯化铁等成分的铁盐作为指示剂。
- 显色： 游离的七叶苷原（6,7-二羟基香豆素）能与Fe³⁺离子发生反应，形成一种在光线下肉眼可见的、具有典型特征的棕黑色至黑色复合物。这种颜色变化是判断结果阳性的关键视觉依据。
- 葡萄糖的作用： 同时释放出的葡萄糖可作为细菌生长的碳源，促进细菌生长和酶的产生，但显色反应主要由七叶苷原与铁离子反应决定。

二、主要检测方法

七叶苷检测可通过多种培养基或试剂体系进行，常见方法如下：

七叶苷琼脂斜面法
- 培养基组成： 基础培养基（如脑心浸液琼脂、胰蛋白胨大豆琼脂）中加入七叶苷（通常0.1%）和柠檬酸铁铵（通常0.05%）。
- 操作： 将待测菌株接种于斜面培养基上，在适宜温度（通常35-37°C）和有氧或特定气体条件下培养18-24小时（有时需延长至48小时）。
- 结果判读：
  - 阳性（+）： 培养基斜面部分或全部变为棕黑色至黑色。
  - 阴性（-）： 培养基无颜色变化，保持原有颜色（通常是浅黄色或琥珀色）。
七叶苷肉汤法
- 培养基组成： 基础肉汤（如脑心浸液肉汤）中加入七叶苷和柠檬酸铁铵。
- 操作： 接种待测菌株于肉汤管中，培养18-24小时。
- 结果判读：
  - 阳性（+）： 整个肉汤或肉汤底部出现棕黑色至黑色沉淀或絮状物，肉汤可能变浑浊。
  - 阴性（-）： 肉汤无黑色出现，可能变浑浊（仅生长）或澄清（不生长）。
七叶苷胆汁培养基（Bile Esculin Agar, BEA）
- 特殊应用： 此方法是鉴定肠球菌属（Enterococcus spp.）和D群链球菌（原包括部分肠球菌）的金标准方法。
- 培养基组成： 在七叶苷琼脂基础上添加高浓度（通常40%）牛胆盐（Oxgall或脱氧胆酸钠）。
- 原理： 牛胆盐能抑制大多数其他链球菌和革兰氏阳性杆菌的生长，但肠球菌和某些D群链球菌能在其中生长，并能水解七叶苷。
- 操作与判读： 接种待测菌株于BEA斜面或平板（点种），培养24-48小时。
  - 阳性（+）： 斜面或菌落周围培养基区域变为棕黑色至黑色（通常菌落生长处及其扩散区域变黑），且有可见菌落生长。
  - 阴性（-）： 培养基无黑色变化（可能有生长或无生长）。注意：仅培养基变黑但无菌落生长（可能由化学水解导致）不能判为阳性；有生长但不变黑为阴性。
快速纸片法/微量生化鉴定系统
- 在商品化的鉴定系统（如API、MicroScan、VITEK等配套试剂条/卡）中，通常包含七叶苷检测小孔或反应杯。
- 原理相同：小孔内含七叶苷和铁盐（或其他显色指示剂）。接种菌悬液并培养后观察孔内颜色变化（变黑为阳性）。
- 操作需严格按照所用系统说明书进行。

三、操作流程要点与注意事项（通用原则）

培养基/试剂准备： 严格按照标准配方配制或使用成品脱水培养基/试剂条。注意灭菌条件对七叶苷热稳定性的影响（高温高压灭菌可能导致部分水解，产生假阳性背景色）。
菌种纯度： 使用纯培养的新鲜菌落进行接种。
接种量： 适中。琼脂斜面或BEA斜面可采用划线接种；肉汤法和纸片法/小孔法采用悬液接种。
培养条件： 提供目标菌株适宜的温度（通常35-37°C）、气体环境（多数需氧或兼性厌氧）和培养时间（通常18-24小时，BEA可达48小时）。培养时间不足可能导致假阴性。
结果判读：
- 明确黑化： 棕黑色至黑色的形成是阳性结果的唯一可靠指标。轻微的棕色或褐色通常不作为阳性依据。
- 区分生长与反应： 在BEA上，必须同时观察到菌落生长和培养基黑化才能判为阳性。
- 及时观察： 结果应在规定培养时间结束后及时读取。过度培养可能导致阴性结果缓慢变黑（假阳性）或阳性结果褪色（假阴性）。
- 光线充足： 在良好光线下观察，必要时使用白色背景。
质量控制（QC）：
- 阳性对照菌株： 如粪肠球菌（Enterococcus faecalis ATCC 29212或51299），应产生阳性结果（培养基黑化）。
- 阴性对照菌株： 如化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes ATCC 19615），应产生阴性结果（无黑化）。
- 培养基/试剂空白： 未接种的培养基应无黑化（或有轻微一致的背景色，明确区别于阳性黑化）。
- 定期进行QC： 新批号试剂/培养基必须进行QC，常规使用中也应定期（如每周或每月）进行QC。

四、临床应用与意义

肠球菌属（Enterococcus）鉴定： 七叶苷胆汁试验（BEA阳性）是鉴定肠球菌属的关键特征之一。绝大多数肠球菌能在40%胆汁中生长并水解七叶苷（BEA阳性）。
D群链球菌鉴定（传统分类）： 过去将能在BEA上生长并水解七叶苷的链球菌归类为D群链球菌（主要包括牛链球菌群和部分肠球菌）。现代分类中，肠球菌已独立成属，而牛链球菌群（如S. bovis group）通常仍呈BEA阳性。该试验仍是区分这些细菌与其他链球菌（如A、B群链球菌通常BEA阴性）的重要指标。
其他细菌鉴定：
- 李斯特菌属（Listeria）：某些种（如单核细胞增生李斯特菌）七叶苷试验通常阳性（非BEA）。
- 气球菌属（Aerococcus）、片球菌属（Pediococcus）、部分乳杆菌（Lactobacillus）等革兰氏阳性球菌或杆菌：七叶苷试验结果（通常非BEA）是鉴定辅助指标。
区分与鉴别： 在链球菌属、肠球菌属及相关菌属的鉴定流程图中，七叶苷检测（特别是BEA试验）常作为关键分枝点，用于区分不同类群。

五、优缺点总结

优点：
- 原理清晰，操作相对简单。
- 结果直观（颜色变化明显）。
- 成本相对较低（尤其是琼脂/肉汤法）。
- 是鉴定肠球菌和D群链球菌相关菌的传统金标准方法（BEA）。
缺点：
- 培养时间相对较长（需18-48小时）。
- 存在假阳性/假阴性的可能（需严格控制条件和QC）。
  - 假阳性风险： 培养基灭菌不当（过热）、过度培养、化学水解、非特异性酶作用。
  - 假阴性风险： 培养时间不足、接种量过少、培养基成分失效（如铁盐浓度不足）、菌株活力差。
- 部分菌种的七叶苷水解能力不稳定或存在菌株差异。
- 依赖于颜色主观判断，微弱反应可能产生歧义（需结合经验）。

六、方法学比较

结论

七叶苷检测，尤其是七叶苷胆汁试验，是临床微生物实验室不可或缺的基础生化试验之一。其基于β-葡萄糖苷酶活性及其与铁离子显色反应的特有原理，为肠球菌、D群链球菌及相关细菌的准确鉴定提供了关键依据。熟练掌握七叶苷检测的原理、多种操作方法（特别是标准BEA法）、结果判读要点和质量控制措施，对于确保微生物鉴定结果的准确性和可靠性至关重要。在实际应用中，七叶苷试验结果需结合革兰氏染色、菌落形态、触酶试验及其他生化反应和自动化鉴定系统结果进行综合分析。