NAD+含量检测 - 中析研究所生物检测中心

NAD+含量检测：原理、方法与应用价值

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）是存在于所有活细胞中的核心辅酶，在能量代谢（如糖酵解、三羧酸循环、氧化磷酸化）、氧化还原平衡、DNA修复（作为PARPs的底物）以及细胞信号传导（如sirtuins的激活）等关键生物过程中发挥着枢纽作用。其细胞内水平的变化与衰老进程、代谢性疾病（如糖尿病、肥胖）、神经退行性疾病以及某些癌症的发生发展密切相关。因此，准确检测生物样本（如细胞、组织、血液）中的NAD+含量，已成为基础研究、临床前药效评价及潜在健康状态评估不可或缺的重要手段。

一、为何需要检测NAD+含量？

精确测定NAD+水平具有多重意义：

基础研究基石： 研究NAD+代谢通路（合成途径如补救途径、从头合成途径；消耗途径如PARPs、CD38/sirtuins）、其调控机制及其在特定生理病理过程中的角色。
评估干预效果： 客观评价旨在提升NAD+水平的策略（如补充前体物质烟酰胺核苷（NR）、烟酰胺单核苷酸（NMN）、烟酸（NA），或应用CD38抑制剂）的实际效果。
健康状态标记物探索： 探索NAD+水平是否可作为反映衰老程度、代谢健康或某些疾病风险的潜在生物学标志物（尽管其作为广泛临床诊断标准的有效性仍需更多研究验证）。

二、主流NAD+含量检测技术

酶循环法
- 原理： 利用NAD+依赖的脱氢酶（常用酒精脱氢酶ADH）特异性催化其底物（如乙醇），同时将NAD+还原为NADH。反应中加入的显色底物（如噻唑蓝MTT、四氮唑蓝INT/WST-8）会被生成的NADH通过电子受体（如吩嗪硫酸甲酯PMS）还原，产生有色化合物（甲臜）。通过检测该有色产物的吸光度（通常在550-570nm或450nm附近），其强度与样本中NAD+浓度呈正比。关键在于利用酶循环反应放大信号，显著提高检测灵敏度。
- 优点： 特异性高（依赖特定脱氢酶）、灵敏度高（可达nmol/L级别）、操作相对简便快捷、成本较低、通量较高（适用于96孔板）、对高端仪器（如质谱）依赖小。
- 缺点： 主要检测总NAD+（NAD+ + NADH），需额外处理区分氧化还原态；可能受样本中其他还原性物质干扰；依赖于酶活性和试剂稳定性。常见的市售试剂盒多基于此原理优化。
高效液相色谱法（HPLC）
- 原理： 样本经提取后，通过色谱柱分离NAD+、NADH以及其他相关代谢物（如NADP+, NADPH, NMN, NR）。分离后的NAD+可利用其紫外吸收特性（最大吸收峰在~260nm）进行定性定量分析。
- 优点： 可同时分离并定量NAD+及其代谢物（区分氧化态NAD+与还原态NADH）；结果直观可视。
- 缺点： 灵敏度相对较低（尤其对复杂生物样本）；易受样本中其他具有相似紫外吸收特性的物质干扰；分析时间较长。
液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）
- 原理： HPLC分离后，进入质谱检测器。NAD+分子在离子源被电离（通常为ESI正离子模式），生成特定质荷比（m/z）的母离子（如[NAD+H]+ m/z 664），进一步在碰撞室碎裂产生特征性子离子（如m/z 136, 腺嘌呤特征碎片），通过多反应监测模式特异性检测这些离子对。使用同位素标记的NAD+（如^13C-NAD+或^15N-NAD+）作为内标，实现高度准确的绝对定量。
- 优点： 金标准方法。 特异性和灵敏度极高（可达pmol/L级别）；能同时精确定量多种NAD+相关代谢物；抗干扰能力最强；可区分不同形态（氧化还原态）。
- 缺点： 仪器昂贵、操作复杂、需要专业人员；样本前处理和数据分析流程耗时；运行成本高。
荧光法
- 原理：
  - 直接法（较少用）： NADH本身具有天然荧光（激发~340nm，发射~460nm），NAD+无此特性。通过化学方法（如酸/碱处理）将NAD+定量转化为荧光性物质进行检测。
  - 酶偶联法（更常用）： 结合酶循环原理，利用生成的NADH在特定波长下的荧光强度定量起始NAD+浓度（信号放大原理同酶循环比色法，但检测终点是荧光而非比色）。
- 优点： 灵敏度通常高于比色法；通量高。
- 缺点： 易受样本自身荧光或淬灭剂干扰；对实验条件（如温度、pH）敏感；酶偶联法成本高于比色法。
生物传感器（研究阶段）
- 原理： 利用基因编码的荧光蛋白生物传感器（如结合NAD+后发生构象变化导致荧光特性改变的蛋白）导入活细胞。通过显微成像技术（如荧光显微镜、共聚焦显微镜）实时监测细胞内NAD+浓度的动态变化。
- 优点： 可在活细胞、亚细胞器水平实现时空动态监测；无需破碎细胞。
- 缺点： 处于技术发展阶段；定量准确性相对经典方法可能稍逊；需要显微成像设备和技术；传感器性能可能受细胞内环境影响。

三、检测流程与技术要点

样本采集与保存：
- 关键性： NAD+代谢非常活跃且在体外极不稳定。不当处理会导致含量快速下降（降解/酶消耗）。
- 操作规范：
  - 快速处理： 离体后应立即置于冰上操作。
  - 快速淬灭： 使用强酸（如HClO4）、强碱（如KOH）、有机溶剂（如乙腈/甲醇）或专用淬灭缓冲液快速灭活代谢酶。酸淬灭（后续需中和）或碱淬灭（直接加热提取）是常用方法。
  - 低温保存： 淬灭后的样本提取液或冻干粉需在-80°C超低温保存，避免反复冻融。
- 常用样本类型：
  - 细胞： 常用直接裂解法（酸/碱/含酶抑制剂的缓冲液）。
  - 组织： 需快速称重，液氮速冻后研磨，再淬灭提取。
  - 血液/血浆/血清： 需特别注意红细胞内高浓度NAD+带来的溶血干扰，需快速分离并淬灭。
样本前处理（提取）：
- 目的： 从淬灭的样本中提取NAD+，去除蛋白质及其他干扰物质。
- 方法： 离心去除沉淀（蛋白质等）；可能需要调节pH（酸提取液需中和）；过滤或固相萃取净化（尤其对LC-MS/MS减少基质效应）。具体方法需匹配选择的检测技术。
检测与分析：
- 根据所选方法（酶循环法、HPLC、LC-MS/MS、荧光法）的标准操作规程进行检测。
- 标准曲线： 每次实验都必须使用已知浓度的纯品NAD+制作标准曲线，这是定量的基础。
- 内标（尤其对于LC-MS/MS）： 使用稳定同位素标记的NAD+作为内标至关重要，可校正提取效率损失和仪器响应波动，显著提高准确度和精密度。
- 空白对照： 检测试剂、溶剂等背景值。
- 质量控制样本： 用于监控检测过程的稳定性和可靠性。
- 归一化： 结果需根据样本属性进行归一化（如细胞数、组织重量、蛋白浓度）以保证可比性。

四、方法选择与挑战

选择依据：
- 目的： 仅需总NAD+？需要区分NAD+/NADH？需要检测多种代谢物谱？
- 灵敏度/准确性要求： 微量样本或低丰度样品需高灵敏度（LC-MS/MS最优）。
- 样本量与通量： 大批量样本筛选可选酶循环法或荧光法（96/384孔板）；少量珍贵样本优选高信息量方法（LC-MS/MS）。
- 设备与成本： LC-MS/MS设备昂贵但数据质量高；酶法试剂盒成本适中易推广。
- 区分形态： 需要区分氧化还原态时，需选用HPLC或LC-MS/MS，或采用特定前处理步骤（如氰化物衍生结合酶法区分NAD+和NADH）。
主要挑战：
- NAD+的不稳定性： 样本处理速度与方法是获得可靠结果的前提。任何延迟或不当操作都会导致结果低估。
- 样本异质性： 不同组织、细胞类型、亚细胞区室的NAD+水平差异显著，需精确取材和定位。
- 基质干扰： 生物样本成分复杂（如血液中的血红蛋白、组织中的脂质），可能干扰检测信号（尤其在比色法、荧光法、HPLC中）。LC-MS/MS配合适宜前处理和同位素内标可有效克服。
- 方法间差异： 不同检测方法甚至不同实验室间的结果可能存在一定差异（尤其在归一化方式和标准品溯源上），比较时应谨慎。

五、总结与展望

NAD+含量检测是深入理解其在生命活动和疾病中作用的关键技术。从经典的酶循环法到高端的LC-MS/MS，每种方法各有千秋，需根据具体研究需求、资源配备和样本特点做出权衡。其中，LC-MS/MS因其卓越的特异性、灵敏度、准确性及多组分同时分析能力，被视为当前NAD+定量的金标准，尤其适用于对数据质量要求极高的研究。而基于酶循环原理的试剂盒则凭借其简便性和性价比，在常规筛选和大量样本检测中广泛应用。

未来NAD+检测技术的发展方向可能聚焦于：