琥珀酸脱氢酶（SDH）含量检测：原理、方法与意义
琥珀酸脱氢酶（Succinate Dehydrogenase， SDH）是三羧酸循环（TCA循环）和线粒体电子传递链（ETC）中的关键酶，负责催化琥珀酸氧化为延胡索酸，同时将电子传递给辅酶Q（泛醌）。作为线粒体内膜标志酶，SDH活性直接反映细胞能量代谢状态、线粒体功能完整性及活性氧生成潜力。其含量或活性检测在基础研究、病理生理学和药物筛选等领域至关重要。
一、SDH的生物学功能与重要性
- 核心代谢节点： 连接TCA循环（催化琥珀酸→延胡索酸）与ETC（复合体II）。
- 能量转换枢纽： 其催化反应产生的电子（经由FADH₂）直接进入ETC驱动质子泵和ATP合成。
- 氧化还原平衡调节者： 参与细胞内还原当量（FADH₂）的产生与利用。
- 潜在ROS来源： 在某些病理条件下（如缺氧、抑制），SDH复合体可产生活性氧（ROS）。
- 疾病标志物： SDH基因突变或功能障碍与多种疾病相关，包括副神经节瘤、嗜铬细胞瘤、肾癌、胃肠间质瘤及某些神经退行性疾病。其活性变化也常反映组织缺血缺氧、衰老、代谢应激等状态。
二、SDH含量/活性检测原理
SDH含量通常通过其酶活性来间接反映，因为酶活性是其功能状态的核心体现。最常用的检测原理是基于其催化反应和电子传递特性：
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核心反应：
琥珀酸 + 受体 ⇌ 延胡索酸 + 还原型受体 -
常用检测原理（比色法为主）：
- 人工电子受体法: SDH可将电子传递给人工合成的电子受体（如铁氰化钾、2,6-二氯靛酚或碘硝基四唑紫），这些受体在接受电子后发生颜色变化。
- 常用显色受体：碘硝基四唑紫（INT）或硝基蓝四唑（NBT）
- SDH催化琥珀酸脱氢产生的电子，通过酶复合体中的铁硫中心，传递给人工电子受体（如INT）。
- 还原态的INT（INT-甲臜）呈水溶性深红色或紫色，在特定波长（如490nm或540nm）有最大吸收峰。
- 显色强度与一定时间内产生的还原态受体量成正比，进而反映SDH的催化活性（通常以单位时间内产物的生成量或底物的消耗量表示）。
三、SDH活性检测实验方法（以组织/细胞匀浆液为例）
注意： 所有操作需在冰上或4°C进行，除非特定步骤要求，以保持酶活性。使用预冷的缓冲液和器材。
(一) 样品制备
- 组织样本：
- 迅速取材，用冰冷的生理盐水或缓冲液（如0.9% NaCl或磷酸盐缓冲液PBS）洗净血液，滤纸吸干。
- 精确称重。
- 加入适量预冷的匀浆缓冲液（推荐：含0.25M蔗糖、1mM EDTA、10mM Tris-HCl, pH 7.4-7.8）。缓冲液体积通常为组织重量的9倍（如100mg组织加900μl缓冲液），制成10%匀浆。
- 冰浴条件下，使用合适的匀浆器充分匀浆（避免起泡和过热）。
- 低温离心（如4°C, 600-1000 × g, 10分钟），取上清液（含胞浆和线粒体）作为待测样品。对于更纯的线粒体SDH检测，需进行线粒体分离纯化。
- 细胞样本（贴壁/悬浮）：
- 用冰冷的PBS轻柔洗涤细胞2-3次。
- 刮下或离心收集细胞，PBS重悬洗涤一次。
- 细胞沉淀中加入适量预冷匀浆缓冲液（体积根据细胞量调整，通常按10⁶细胞加50-100μl）。
- 冰浴条件下，超声破碎细胞（短时多次，避免过热）或用注射器反复吹打。
- 低温离心（4°C, 600-1000 × g, 10分钟），取上清液作为待测样品。
- 样品蛋白浓度测定： 使用标准方法（如BCA法、Bradford法、Lowry法）测定上清液中总蛋白浓度，用于后续酶活性标准化（单位：U/mg prot）。
(二) SDH活性测定（以INT法为例）
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反应体系（示例，需优化）：
- 反应缓冲液（预温至37°C）： 0.2M 磷酸钠缓冲液 (pH 7.8)，含0.6mM INT，0.1mM 磷酸烯醇丙酮酸 (PEP，可选，抑制内源性丙酮酸脱氢酶干扰)，适量叠氮钠 (NaN₃, 可选，抑制细胞色素氧化酶）。
- 底物溶液： 0.5M 琥珀酸钠溶液 (用NaOH调pH至7.0-7.5)。
- 样品： 适量酶提取液（保证反应线性范围内的酶量）。
- 终止液： 含适量SDS（十二烷基硫酸钠）或盐酸的溶液（用于终止反应并使显色稳定）。
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操作步骤：
- 在比色皿或微孔板孔中加入预温的反应缓冲液（如800μl）。
- 加入预温的底物溶液（如100μl，终浓度约50mM琥珀酸）。
- 37°C水浴预热混合物3-5分钟。
- 准确加入适量样品（如100μl，空白管用等体积匀浆缓冲液代替），立即混匀并开始计时。
- 37°C避光精确反应一定时间（如5-15分钟，需在反应线性期内）。
- 迅速加入预冷的终止液（如200μl），充分混匀以终止反应。
- 室温放置数分钟使显色稳定（或按试剂要求操作）。
- 在分光光度计或酶标仪上，于490nm或540nm波长处（根据INT-甲臜的最大吸收峰设定），以空白管调零，测定各管的吸光度值（OD）。
(三) 标准曲线（可选但推荐）
- 配制已知浓度的还原态INT（INT-甲臜）标准品溶液。
- 在相同条件下测定各浓度标准品的OD值。
- 绘制OD值对还原态INT浓度的标准曲线（通常为直线）。
- 通过样品OD值在标准曲线上查得对应还原态INT生成量（nmol）。
(四) 数据处理与计算
- 计算还原产物生成量：
- 有标准曲线： 样品OD值 - 空白OD值 = 净OD值。从标准曲线上查出净OD值对应的还原态INT生成量（nmol）。
- 无标准曲线（用摩尔消光系数ε）： 还原态INT的摩尔消光系数（ε）在特定波长下是已知的（需查文献或试剂说明）。生成量(nmol) = (净OD值 × 反应液总体积 ml × 1000) / (ε × 比色皿光径 cm) * (样品加入体积 ml / 反应液总体积 ml)。
公式简化为：生成量 (nmol) = (ΔOD × Vt × 1000) / (ε × d)(其中Vt为反应终止后总液体体积ml，d为光径cm)。
- 计算酶活性：
- 酶活力单位 (U)： 定义：在特定测定条件下（温度、pH），每分钟催化生成1 μmol（或1 nmol）还原产物所需的酶量。
- 样品酶活力 (U/ml或U/mg prot)：
酶活力 (U/ml) = [生成量 (nmol/min) × 1000] / [反应时间 (min) × 样品体积 (ml)]或 酶活力 (U/mg prot) = [生成量 (nmol/min) × 1000] / [反应时间 (min) × 样品体积 (ml) × 样品蛋白浓度 (mg/ml)]- 注意单位换算：生成量是nmol，1 μmol = 1000 nmol，所以公式中乘以1000是将nmol换算成μmol。也可直接定义活力单位为nmol/min/mg prot。
- 报告结果： 通常以 平均值 ± 标准差 (SD) 表示样本的SDH活性（单位：U/mg prot 或 nmol/min/mg prot）。
四、关键影响因素与注意事项
- 样品新鲜度与处理： 离体组织需立即处理，全程低温操作。反复冻融会严重降低酶活。匀浆需充分但避免过度。
- 反应条件控制：
- 温度： 严格控制反应温度（通常37°C），温度波动影响反应速率。
- pH： 缓冲液pH值精确（通常7.4-7.8），偏离最适pH显著影响活性。
- 线性范围： 必须确保反应时间在产物生成量与时间呈线性的范围内（通过预实验确定）。样品加入量也应在酶活力与样品量成线性关系的范围内。
- 底物浓度： 琥珀酸浓度需达到饱和（Km值以上），避免底物限制。通常终浓度40-50mM。
- 抑制剂与干扰：
- 丙二酸： SDH的竞争性抑制剂，常用作阴性对照。可在反应体系中加入丙二酸验证反应特异性。
- 内源性干扰物： 组织/细胞提取物中的色素、脂质或其他还原性物质（如GSH、抗坏血酸）可能干扰显色。需设置严格的样品空白（不加底物）或使用抑制对照（加丙二酸）。必要时可透析样品去除小分子干扰物。
- 金属离子： 某些金属离子（如Hg²⁺, Cu²⁺）是强抑制剂。
- 人工电子受体选择： INT/NBT应用最广，但需避光防止自身还原。铁氰化钾法终点检测干扰相对小，但灵敏度可能略低。选择需权衡灵敏度和特异性。
- 终止反应： 加入终止液需迅速彻底，确保反应立即停止，显色稳定。
- 蛋白浓度测定： 准确测定蛋白浓度对标准化结果至关重要。
- 平行实验与对照： 设置试剂空白、样品空白（不加底物或用缓冲液代替样品）、抑制对照（加丙二酸）和标准品（如有），每组样品做复孔。
五、方法学评价与应用
- 优点： 原理清晰直接（基于SDH催化功能）；操作相对简便；成本较低（常用试剂易得）；灵敏度通常满足常规研究需求；仪器要求不高（分光光度计或酶标仪）。
- 局限性： 存在内源性干扰风险；结果反映的是酶活性而非绝对蛋白含量（活性易受环境因素影响）；对线粒体损伤敏感（需保持SDH在线粒体膜上复合体的完整性）。
- 应用场景：
- 基础研究： 评估细胞/组织能量代谢状态、线粒体功能。
- 病理机制研究： 探究缺氧/缺血再灌注损伤、神经退行性疾病、癌症、代谢性疾病（如糖尿病、肥胖）中线粒体功能障碍。
- 药物研发与筛选： 评价药物对线粒体功能的影响（增效剂或抑制剂）。
- 毒理学： 评估环境毒素、重金属对线粒体的毒性作用。
- 农业/食品科学： 研究植物抗逆性、果实成熟衰老、食品加工对细胞代谢的影响。
六、结论
碘硝基四唑紫（INT）比色法是检测琥珀酸脱氢酶（SDH）活性的经典、可靠方法。通过严格控制样品制备、反应条件（温度、pH、时间、底物饱和）并设置必要的对照，该方法能有效反映样本中SDH的催化能力，从而间接评估线粒体功能状态和细胞能量代谢水平。理解其原理、掌握操作要点并注意规避干扰因素是获得准确、可重复结果的关键。SDH活性检测作为评估细胞能量代谢核心环节的重要工具，在生命科学和医学研究的众多领域持续发挥着不可替代的作用。
（注意：文中提及的试剂如INT、NBT、PEP、SDS、NaN₃等均为通用化学名称或缩写，不涉及任何特定品牌或厂商。）