6-磷酸葡萄糖（G6P）含量检测技术指南
一、检测意义
6-磷酸葡萄糖是糖代谢的核心中间产物，参与糖酵解、磷酸戊糖途径和糖原合成。其含量变化可反映：
- 细胞能量代谢状态
- 磷酸戊糖途径活性（NADPH生成）
- 遗传性代谢疾病（如G6PD缺乏症）
- 糖尿病、肿瘤等病理进程研究
二、检测方法原理
1. 酶偶联法（主流方法）
反应原理：
G6P + NADP⁺ → 6-磷酸葡萄糖酸内酯 + NADPH + H⁺ （G6PDH催化） NADPH在340nm处有特征吸收峰，吸光度变化与G6P浓度成正比特点： 特异性高、灵敏度达μM级、适用于生物样本
2. 高效液相色谱法（HPLC）
- 色谱柱：氨基柱或阴离子交换柱
- 检测器：紫外检测器（190-210nm）或示差折光检测器
- 前处理：样本需经蛋白沉淀（如乙腈）和过滤
3. 质谱联用法（LC-MS/MS）
- 采用同位素内标（如¹³C-G6P）
- 检测模式：负离子模式，母离子m/z 259→子离子m/z 97/79
- 金标准方法，灵敏度可达nM级
三、酶法检测详细流程（以组织样本为例）
试剂准备
- 反应缓冲液：50mM Tris-HCl (pH 8.1)，含5mM MgCl₂
- 酶混合液：1.5 U/mL G6PDH，2mM NADP⁺
- G6P标准品梯度：0, 10, 20, 50, 100 μM
样本处理
- 取100mg组织加入1mL预冷0.6M高氯酸，匀浆
- 离心（12,000g, 4℃, 10min）取上清
- 用2M KOH中和至pH 7.0，再次离心去沉淀
检测步骤
- 将50μL样本/标准品加入96孔板
- 加入150μL酶混合液启动反应
- 立即在340nm波长下监测吸光度（25℃），每30秒读数共5分钟
计算方式
G6P (μmol/g) = (ΔA_sample / ΔA_standard) × C_standard × 稀释倍数 / 组织重量(g)注：ΔA取反应线性期的斜率
四、关键注意事项
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样本稳定性
- 组织样本需液氮速冻，-80℃保存
- 提取液在4℃下4小时内完成检测
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干扰控制
- 避免使用含巯基的保护剂（如DTT会干扰NADPH测定）
- 高蛋白样本需增加沉淀步骤
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方法学验证
- 加标回收率应控制在95-105%
- 批内CV＜5%，批间CV＜8%
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特殊样本处理
- 红细胞样本：需快速淬灭防止G6P降解
- 培养细胞：建议使用预冷PBS冲洗后直接裂解
五、应用场景示例
六、方法比较
七、参考文献
- Bergmeyer HU. Methods of Enzymatic Analysis. 3rd ed. Verlag Chemie; 1983.
- TeSlaa T, et al. Bio-protocol. 2016;6(24):e2081.
- Luo B, et al. Anal Biochem. 2019;576:29-35.
本指南基于公开文献整理，内容覆盖原理、操作及质控要点，可满足科研与临床检测需求。实际操作请参照实验室标准规程并根据具体样本优化条件。