1, 6-二磷酸果糖含量检测

发布时间：2025-06-25 14:33:53 阅读量：6 作者：生物检测中心
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1,6-二磷酸果糖含量检测完整指南

一、引言

1,6-二磷酸果糖（Fructose-1,6-bisphosphate，简称 FDP 或 F1,6BP）是糖酵解途径中的关键中间代谢物。它由磷酸果糖激酶催化6-磷酸果糖生成，随后被醛缩酶裂解为磷酸二羟丙酮和3-磷酸甘油醛。FDP 含量是反映细胞内糖酵解活性的重要指标，其水平变化与多种生理和病理过程密切相关，例如能量代谢状态、缺氧应激、某些遗传性代谢疾病（如醛缩酶缺乏症）、肿瘤代谢研究以及植物抗逆生理等。因此，准确测定生物样品中 FDP 的含量具有重要的基础研究和临床诊断价值。

二、主要检测方法

目前检测 FDP 含量的方法主要基于其特异性酶促反应或物理化学性质，以下介绍几种常用且可靠的方法：

  1. 酶偶联分光光度法（最常用）：

    • 原理： 利用 FDP 作为底物的特异性酶促反应，并偶联产生可被分光光度计检测的信号（通常是 NADH 或 NADPH 在 340 nm 的吸光度变化）。
    • 核心反应：
      1. 醛缩酶 (Aldolase) 催化： FDP 被醛缩酶裂解为磷酸二羟丙酮 (Dihydroxyacetone phosphate, DHAP) 和 3-磷酸甘油醛 (Glyceraldehyde-3-phosphate, G3P)。
      2. 磷酸丙糖异构酶 (Triosephosphate isomerase, TPI) 催化： G3P 被 TPI 快速异构化为 DHAP。至此，1 分子 FDP 产生 2 分子 DHAP。
      3. 甘油-3-磷酸脱氢酶 (Glycerol-3-phosphate dehydrogenase, GPDH) 催化： DHAP 在还原型辅酶Ⅱ (NADH) 存在下，被 GPDH 还原为甘油-3-磷酸 (Glycerol-3-phosphate)，同时 NADH 被氧化为 NAD⁺，导致 340 nm 处吸光度下降。反应方程式如下： FDP → 2 DHAP (通过 Aldolase + TPI) 2 DHAP + 2 NADH + 2 H⁺ → 2 Glycerol-3-phosphate + 2 NAD⁺ (通过 GPDH)
    • 检测： 通过监测反应体系在 340 nm 波长处吸光度 (A₃₄₀) 的下降速率或下降总量（与消耗的 NADH 量成正比），再根据标准曲线或摩尔消光系数计算样品中 FDP 的含量。
    • 优点： 特异性高、灵敏度较好（可达 μM 级）、操作相对简便、成本适中、易于自动化。
    • 关键点： 需要高纯度的酶和 NADH；反应需在适宜 pH 的缓冲液中进行；样品中可能存在的干扰物质（如其它磷酸糖、内源性脱氢酶或 NADH 氧化酶）需要评估和处理（如样品预处理）。

  2. 酶促荧光法：

    • 原理： 基本反应原理与酶偶联分光光度法相同，核心仍然是利用醛缩酶、TPI 和 GPDH 的级联反应消耗 NADH。区别在于检测信号不是 NADH 的吸光度，而是利用 NADH 本身在特定波长激发下产生的荧光（激发光~340 nm，发射光~460 nm）强度的下降。
    • 优点： 灵敏度通常比分光光度法更高（可达 nM 级），抗背景干扰能力更强，特别适合微量样品或 FDP 含量极低的样品。
    • 缺点： 需要荧光分光光度计，成本可能更高；荧光易受环境因素（如温度、溶剂、淬灭剂）影响。

  3. 高效液相色谱法 (HPLC)：

    • 原理： 利用反相色谱柱或离子交换色谱柱分离样品中的 FDP 及其他糖磷酸化合物，然后通过检测器进行定性和定量分析。
    • 检测器：
      • 紫外检测器 (UV)： FDP 在接近 200 nm 的低波长下有弱吸收。灵敏度较低，易受干扰。
      • 示差折光检测器 (RID)： 通用型检测器，但灵敏度较低，对温度波动敏感，不适合梯度洗脱。
      • 电化学检测器 (ECD)： 对某些糖磷酸有较好的灵敏度和选择性，但条件优化较复杂。
    • 优点： 可同时分析多种糖磷酸中间体；特异性由色谱分离保证。
    • 缺点： 样品前处理通常较繁琐（如去蛋白）；仪器昂贵；运行成本较高；方法开发相对复杂；灵敏度可能不如酶法（尤其是使用 UV 或 RID 时）。

  4. 液相色谱-质谱联用法 (LC-MS/MS)：

    • 原理： HPLC 分离后，进入质谱仪进行离子化和质量分析。通常采用电喷雾离子源 (ESI)，在负离子模式下检测 FDP 的特征母离子及子离子碎片。
    • 优点： 是目前最灵敏（可达 nM 甚至 pM 级）和最特异的方法；可同时准确定量多种代谢物；是复杂生物基质中痕量 FDP 分析的“金标准”。
    • 缺点： 仪器非常昂贵；运行和维护成本高；需要专业的技术人员进行操作和数据分析；样品前处理要求高。

三、样品采集与处理（通用关键步骤）

样品的正确处理是获得准确结果的前提：

  1. 快速淬灭代谢： 生物样本（细胞、组织、血液）一旦离体，代谢活动仍在继续，FDP 水平会迅速变化。必须立即使用强酸（如高氯酸）、液氮速冻、或投入预冷的代谢淬灭试剂（如含高浓度甲醇/乙醇的缓冲液）等方式终止酶活性。
  2. 去蛋白： 大多数方法需要去除蛋白质。常用方法：
    • 酸提取： 加入冷高氯酸 (PCA)，离心取上清，然后用 KOH 中和并去除沉淀的 KClO₄。注意中和时的温度控制（冰浴）和 pH 调节。
    • 有机溶剂沉淀： 如甲醇、乙醇、乙腈等。
  3. 离心： 淬灭和去蛋白后，需要充分离心（通常 4°C，高速）去除沉淀物，获取澄清的上清液用于分析。
  4. 分装与保存： 处理好的样品上清应尽快分析。如需保存，应分装后置于 -80°C 超低温冰箱中，避免反复冻融。
  5. 注意事项： 整个处理过程需在低温（冰浴）下操作，防止 FDP 降解；使用无磷酸酶的耗材（如离心管、枪头）；操作迅速。

四、实验操作要点与注意事项（以酶偶联分光光度法为例）

  1. 试剂准备：
    • 使用高纯度试剂和去离子水。
    • 配制反应缓冲液（常用 Tris-HCl 或三乙醇胺缓冲液，含 Mg²⁺等辅助因子），精确调节 pH。
    • 酶溶液（醛缩酶、TPI、GPDH）通常需临用前配制或按说明书要求溶解保存，保持低温。
    • NADH 溶液需新鲜配制或分装避光保存于 -20°C，避免反复冻融和氧化失效。
    • 制备 FDP 标准品系列溶液。
  2. 反应体系建立：
    • 在比色皿或微孔板中依次加入缓冲液、NADH、酶混合液（Aldolase + TPI + GPDH）。
    • 混匀，预热至反应温度（通常 25°C 或 37°C）。
    • 加入待测样品或标准品启动反应。
    • 立即混匀，开始监测 A₃₄₀ 随时间的变化。
  3. 检测：
    • 使用预热好的分光光度计或酶标仪。
    • 连续监测 A₃₄₀ 下降的初始速率（动力学法）或记录反应达到终点时的总吸光度变化（终点法）。动力学法更常用，受干扰小。
    • 确保反应在吸光度变化与时间呈良好线性关系的区间内读数。
  4. 标准曲线与计算：
    • 使用不同浓度的 FDP 标准品进行同样操作，测定其对应的 ΔA₃₄₀/min 或 ΔA₃₄₀。
    • 绘制标准曲线（FDP 浓度 vs. ΔA₃₄₀/min 或 ΔA₃₄₀）。
    • 根据样品的吸光度变化值，从标准曲线上查出或通过回归方程计算出样品中 FDP 的浓度。
    • 考虑样品的稀释倍数，计算原始样品中 FDP 的含量（如 μmol/g 组织湿重、μmol/10¹⁰ 细胞、μmol/L 血液等）。
  5. 注意事项：
    • 空白对照： 设置试剂空白（不加样品）和样品空白（不加酶或 NADH）以扣除背景干扰。
    • 内源性干扰： 样品中可能含有内源性 NADH 或 NADH 氧化酶活性，需通过设置样品空白或进行样品预处理（如微孔过滤）来评估和校正。
    • 线性范围： 确保样品吸光度变化在标准曲线的线性范围内，否则需稀释样品。
    • 温度控制： 反应温度需精确恒定。
    • 避光： NADH 对光敏感，操作过程尽量避光。
    • 酶活性： 确保酶有足够的活性，必要时进行酶活性测试。

五、结果解读与应用

  • 单位： 结果通常表示为 μmol/g 湿重（组织）、μmol/10¹⁰ 细胞（细胞）、μmol/L（血液/体液）或 nmol/mg 蛋白（蛋白归一化）等。
  • 参考范围： FDP 水平因物种、组织类型、生理状态（如摄食、运动、缺氧）和检测方法而异。需参考相关文献或建立实验室自身的参考范围。例如，人红细胞中 FDP 浓度通常在几十 μM 水平。
  • 应用场景：
    • 基础研究： 研究糖酵解通量调控、能量代谢、信号转导、细胞应激反应（如缺氧、氧化应激）、肿瘤代谢重编程（瓦博格效应）等。
    • 临床诊断： 辅助诊断遗传性果糖代谢障碍（如醛缩酶 A 缺乏症）、评估某些溶血性贫血状态、监测危重病人的能量代谢状态（如脓毒症、休克）。
    • 植物生理： 研究植物光合作用、糖代谢、抗逆性（如低温、干旱）。
    • 药物研发： 评估影响糖酵解途径的药物的效应。

六、总结

1,6-二磷酸果糖（FDP）作为糖酵解的核心中间体，其含量检测是研究细胞能量代谢和相关疾病的重要手段。酶偶联分光光度法因其特异性、灵敏度和操作便捷性成为最广泛应用的常规方法。高效液相色谱法（HPLC）和液相色谱-质谱联用法（LC-MS/MS）则在高通量、多组分分析或痕量检测中具有优势。无论采用何种方法，样品的快速淬灭、妥善处理和标准化操作流程是保证检测结果准确可靠的关键。理解 FDP 的生理病理意义并结合具体研究背景解读数据，才能充分发挥其在科研和临床中的价值。